Khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm sau của dược liệu hạt cần tây: 1. Mô tả 2. Vi phẫu 3. Bột 4. Định tính 5. Độ ẩm 6. Tro toàn phần
7. Chất chiết được trong dược liệu 8. Tạp chất
9. Tỷ lệ vụn nát 10. Định lượng.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Cảm quan
- Mô tả dược liệu: Quan sát mẫu ở ánh sáng thường. Mô tả hình dạng, k ch thước, màu sắc, mùi, vị và thể chất của dược liệu [1].
2.3.2. Kiểm nghiệm bằng phƣơng pháp hiển vi
- Bột dược liệu: Sấy khô dược liệu hạt trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C sau đó dùng thuyền tán và chày cối sứ hoặc máy xay nghiền nhỏ. Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến k nh đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột dược liệu.
phẫu.
- Chụp ảnh đặc điểm bột và vi phẫu bằng máy ảnh Canon. Xử lý ảnh bằng phần mềm PHOTOSHOP CS8.
2.3.3. Kiểm nghiệm bằng phƣơng pháp hoá học
- Định tính flavonoid, coumarin trong hạt cần tây bằng phản ứng hóa học theo phương pháp ghi trong tài liệu [20].
Định tính flavonoid: Phản ứng cyanidin, phản ứng với kiềm, phản ứng với FeCl3 5%.
Định tính coumarin: Phản ứng mở, đóng vòng lacton; quan sát hiện tượng huỳnh quang.
- S LM: Định t nh dược liệu hạt cần tây bằng S LM theo phương pháp ghi trong
Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 5.4) [2].
2.3.4. Độ ẩm
- Dược liệu thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn, quá độ ẩm đó thì dược liệu dễ bị mốc, hư hỏng. Việc xây dựng chỉ tiêu độ ẩm cho dược liệu là xác định giới hạn tối đa cho phép của một dược liệu để nó có thể giữ được chất lượng trong quá trình bảo quản [1].
- Xác định độ ẩm bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô hay phương pháp sấy theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 9.6) [2].
2.3.5. Tro toàn phần
- Tro toàn phần là lượng cắn vô cơ còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược liệu. Cắn vô cơ có cấu tạo chủ yếu là các carbonat và oxyd kim loại [1].
- Tiến hành tro hóa hoàn toàn mẫu thử tại một điều kiện nung nhất định trong 1g mẫu thử theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 9.8) [2].
2.3.6. Chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu
Xác định chất chiết được trong dược liệu theo phương pháp ghi trong Dược điển
Việt Nam IV (Phụ lục 12.10) [2].
Xác định tạp chất lẫn trong dược liệu theo phương pháp ghi trong Dược điển
Việt Nam IV (Phụ lục 12.11) [2].
2.3.8. Tỷ lệ vụn nát
Xác định tỷ lệ vụn nát của dược liệu theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt
Nam IV (Phụ lục 12.12) [2].
2.3.9. Định lƣợng
Định lượng flavonoid toàn phần trong hạt cần tây bằng phương pháp đo quang: - Tiến hành chiết xuất dịch chiết hạt cần tây và loại tạp.
- Làm phản ứng tạo màu với dung dịch triethylamin 1% trong methanol. - Khảo sát cực đại hấp thụ
- Khảo sát khoảng tuyến tính.
- Sử dụng kĩ thuật đường chuẩn để xác định được nồng độ chất cần phân t ch có trong mẫu định lượng, từ đó t nh ra hàm lượng flavonoid có trong mẫu dược liệu.
- Thẩm định phương pháp: hảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp.
2.3.10. Xử lý kết quả thực nghiệm
Kết quả thực nghiệm lưu trữ và tính toán bằng phần mềm MICROSOFT EXCEL sử dụng T-test với khoảng tin cậy 95% (α = 0,05).
3.1. Khảo sát và xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dƣợc liệu hạt cần tây 3.1.1. Mô tả
Dược liệu là quả ch n phơi hay sấy khô của cây cần tây (Apium graveolens L.), họ Cần (Apiaceae).
Mô tả: Hạt rất nhỏ, màu nâu, hình bầu dục, dài khoảng 1-1,5 mm, rộng khoảng 0,5-1 mm, có 5 cánh, mép ngoài mỗi cánh màu vàng nhạt. Mùi thơm đặc trưng, vị đắng, hơi cay.
Ảnh chụp hạt cần tây quan sát bằng mắt thường và dưới kính lúp soi nổi Leica EZ4 được trình bày ở hình 3.1.
Quan sát bằng mắt thường Quan sát dưới kính lúp Leica EZ4
Hình 3.1. Ảnh chụp hạt cần tây quan sát bằng mắt thƣờng và dƣới kính lúp Leica EZ4
3.1.2. Bột
Bột màu nâu, mùi thơm, vị đắng, hơi cay. Soi dưới k nh hiển vi thấy các đặc điểm:
- Mảnh biểu bì (1) gồm những tế bào hình chữ nhật, xếp sát nhau. - Mảnh mô mềm (2) gồm những tế bào hình tròn, thành mỏng. - Mảnh nội nhũ (3) gồm những tế bào dài, thành mỏng.
- Mảnh mạch điểm (4). - Sợi dài (5) đứng riêng lẻ.
- Hạt tinh bột (6) hình tròn, rốn hạt hình sao, nằm rải rác, k ch thước 0,012- 0,015 mm.
Ảnh chụp các đặc điểm bột hạt cần tây dưới k nh hiển vi được trình bày ở hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh chụp các đặc điểm bột hạt cần tây dƣới k nh hiển vi
Ghi chú:
1. Mảnh biểu bì 4. Mảnh mạch điểm
2. Mảnh mô mềm 5. Sợi
3. Mảnh nội nhũ 6. Tinh bột
3.1.3. Vi phẫu
Quan sát dưới kính hiển vi, hạt cần tây gồm hai nửa đối xứng, có nhiều rãnh, mỗi bên có 1 lá noãn, từ ngoài vào trong có các đặc điểm:
Biểu bì (1) gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn. Mô mềm vỏ (2) gồm 6- 7 lớp tế bào hình tròn, thành mỏng, xếp lộn xộn. Libe-gỗ xếp thành 12 bó, libe (3) ở ngoài, gỗ (4) ở trong. Mỗi thùy quả và ở phần tiếp giáp 2 lá noãn có 1 bó libe-gỗ. Ống tiết tinh dầu (5) xếp thành vòng nằm gần sát lớp vỏ trong. Có tất cả 20 ống tiết
Ảnh chụp vi phẫu hạt cần tây dưới kính hiển vi được trình bày ở hình
3.3.
Hình 3.3. Ảnh chụp vi phẫu hạt cần tây dƣới kính hiển vi
Ghi chú: 1. Biểu bì 2. Mô mềm vỏ
3. Libe 4. Gỗ
5. Ống tiết tinh dầu
3.1.4. Định t nh
3.1.4.1. Định tính bằng các phản ứng hóa học
Cân chính xác khoảng 10 g bột hạt cần tây cho vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm 30 ml ethanol 90%, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng định tính sau:
a. Định tính flavonoid
- Phản ứng cyanidin: Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi.
Nhỏ từ từ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt). Để yên một vài phút, dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.
Kết quả: Phản ứng dương t nh (+).
- Phản ứng với kiềm:
Phản ứng với NH3: Nhỏ 2-3 giọt dịch lọc lên một tờ giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên.
Kết quả: Phản ứng dương t nh (+).
Phản ứng với dd NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện tủa vàng. Thêm 1 ml nước cất thấy tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên.
Kết quả: Phản ứng dương t nh (+).
- Phản ứng với dd FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc. Thêm vào 2-3 giọt
dung dịch Sắt (III) clorid 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen.
Kết quả: Phản ứng dương t nh (+).
Kết luận: Trong hạt cần tây có flavonoid. b. Định tính coumarin
- Phản ứng mở, đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch lọc. Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Ống 2: Để nguyên
Đun cả 2 ống đến sôi, để nguội, quan sát thấy: Ống 1: Xuất hiện tủa vàng
Ống 2: Trong
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát thấy Ống 1: Trong suốt
Ống 2: Có tủa đục
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 trở lại tủa đục như ống 2.
Kết quả: Phản ứng dương t nh (+).
- Quan sát hiện tượng huỳnh quang
Nhỏ 2-3 giọt dịch lọc lên một khoanh giấy thấm. Nhỏ 2-3 giọt dung dịch NaOH 5% lên vị trí có dịch chiết. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sáng dần lên, sau vài phút cả 2 phần đều phát quang như nhau.
Kết luận: Trong hạt cần tây có chứa coumarin.
Từ kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy trong hạt cần tây có flavonoid và coumarin. Tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần cho thấy các phản ứng định tính flavonoid và coumarin trong hạt cần tây đều cho kết quả dương t nh rõ.
Đề nghị: Chọn các phản ứng định tính flavonoid và phản ứng mở, đóng vòng lacton định tính coumarin làm chỉ tiêu định tính trong dự thảo tiêu chuẩn hạt cần tây.
3.1.4.2. Sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng: Silica gel F254 đã hoạt hóa ở 110ºC trong 1 giờ.
Dung môi khai triển:
Hệ I: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic - Methanol (4:4:0,5:1) Hệ II: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1)
Dung dịch thử: Cân khoảng 5 g bột dược liệu, chiết bằng ether dầu hỏa trong
bình soxhlet đến khi dịch chiết ether dầu hỏa hết chất béo. Bã dược liệu đem chiết tiếp bằng methanol trong bình soxhlet trong 1 giờ. Lấy 10 ml dịch chiết methanol cô cách thủy đến khi thu được khoảng 1 ml dung dịch thử để chấm sắc ký.
Dung dịch chuẩn: Hòa tan 1 mg apigenin chuẩn trong 10 ml methanol, khuấy
đều thu được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng dung dịch thử và dung dịch đối
chiếu. Khai triển sắc ký với hệ dung môi I hoặc hệ dung môi II. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm. Hiện màu bằng thuốc thử vanilin- acid sulfuric.
Kết quả:
Kết quả định tính dịch chiết hạt cần tây bằng SKLM với hệ dung môi I được trình bày ở sắc ký đồ hình 3.4.
Kết quả định tính dịch chiết dược liệu hạt cần tây bằng SKLM với hệ dung môi II được trình bày ở sắc ký đồ hình 3.5.
Ghi chú hình 3.4 và hình 3.5:
UV254: Sắc ký đồ quan sát ở UV254
UV366: Sắc ký đồ quan sát ở UV366
TT vanilin/H2SO4: Sắc ký đồ hiện vết bằng thuốc thử vanilin-acid sulfuric.
T: Dung dịch thử
C: Apigenin chuẩn
Nhận xét: Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại và sau khi hiện vết bằng thuốc thử vanilin-acid sulfuric thấy cả 2 hệ dung môi đều tách tốt, hệ I cho 9 vết, hệ II cho 6 vết. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử ở cả hai hệ dung môi I và II đều có vết tương ứng với vết apigenin trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu với Rf tương ứng là 0,53 và 0,59. Điều đó chứng tỏ dịch chiết hạt cần tây có chứa apigenin.
Hình 3.4.
Ảnh chụp sắc ký đồ dịch chiết EtOH hạt cần tây với hệ dung môi I
Hình 3.5.
Ảnh chụp sắc ký đồ dịch chiết EtOH hạt cần tây với hệ dung môi II
nghiệm hạt cần tây bằng SKLM.
3.1.5. Độ ẩm
Nguyên tắc: Sấy dược liệu tới khối lượng không đổi ở 105oC. Khối lượng mẫu thử giảm đi là khối lượng nước.
Độ ẩm (X%) của dược liệu được tính theo công thức sau: X% = P: Số gam của mẫu thử trước khi sấy
A: Số gam của mẫu thử sau khi sấy
Tiến hành: Xác định độ ẩm dược liệu bằng máy xác định độ ẩm Precisa XM60.
Kết quả: Kết quả xác định độ ẩm của dược liệu hạt cần tây được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của dược liệu hạt cần tây
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Thống kê Độ ẩm (%) 8,98 9,07 8,96 8,79 9,11 8,92 8,97 ± 0,29 % (α = 0,05) Nhận xét: Độ ẩm của hạt cần tây là 8,97 ± 0,29 % (α = 0,05). Đề nghị: Độ ẩm của hạt cần tây không quá 12 %.
3.1.6. Tro toàn phần
Xác định tro toàn phần của hạt cần tây theo phương pháp ghi trong Dược điển
Việt Nam IV (Phụ lục 9.8) [2].
Tiến hành: Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 - 105oC rồi đem nung trong lò nung ở 600oC. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem ra làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Trong qua trình thao tác không được để tạo thành ngọn lửa. Nếu sau khi đã nung lâu mà vẫn chưa loại hết carbon của tro thì
dùng nước nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Hợp dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi.
Tro toàn phần được tính theo công thức: 2 1 100 m X m
Trong đó: m1: Khối lượng dược liệu khô tuyệt đối (g). 2
m : Khối lượng tro (g) m: Khối lượng dược liệu (g) Độ ẩm bột hạt cần tây 8,97%.
Kết quả: Tỷ lệ phần trăm tro toàn phần của hạt cần tây được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tỷ lệ phần trăm tro toàn phần của hạt cần tây
Lần m (g) m1 (g) m2 (g) X (%) 1 0,9735 0,8862 0,1131 12,76 2 0,9968 0,9074 0,1161 12,79 3 0,9945 0,9053 0,1185 13,09 4 0,9954 0,9061 0,1276 14,08 5 0,9966 0,9072 0,1179 13,00 6 1,0011 0,9113 0,1249 13,71 Thống kê 13,24 ± 1,38 % (α = 0,05)
Nhận xét: Tỷ lệ phần trăm tro toàn phần của hạt cần tây là 13,24 ± 1,38 % (α = 0,05).
Đề nghị: Tro toàn phần của hạt cần tây không quá 15 %. 3.1.7. Chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu
Xác định chất chiết được bằng ethanol trong dược liệu theo phương pháp chiết nóng ghi trong Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 12.10) [2].
vào bình nón 100 hoặc 250 ml. Thêm chính xác 100,0 ml cồn tuyệt đối, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ, sau đó đun sôi nhẹ dưới hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy k n, cân để xác định lại khối lượng, dùng cồn tuyết đối để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô, cắn thu được sấy ở 105 0C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn. Tính phần trăm lượng chất chiết được bằng cồn tuyệt đối theo dược liệu khô.
Phần trăm chất chiết được bằng ethanol trong dược liệu tính theo công thức: 2 1 100 m X m
m1: Khối lượng dược liệu khô tuyệt đối (g).
m2: Khối lượng chất chiết được (g).
Kết quả: Phần trăm chất chiết được bằng ethanol trong hạt cần tây được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Phần trăm chất chiết được bằng ethanol trong hạt cần tây
Lần m1 (g) m2 (g) X (%) 1 3,6244 0,3512 9,69 2 3,6367 0,3456 9,50 3 3,6691 0,3260 8,89 4 3,6855 0,3692 10,02 5 3,6458 0,3640 9,98 6 3,6532 0,3324 9,10 Thống kê 9,53 ± 0,48 % (α = 0,05)
Nhận xét: Phần trăm chất chiết được bằng ethanol trong hạt cần tây là 9,53 ± 0,48 % (α = 0,05).
Đề nghị: Chất chiết được bằng ethanol trong hạt cần tây không t hơn 7 % t nh theo dược liệu khô tuyệt đối.
3.1.8. Tạp chất
Tạp chất lẫn trong dược liệu bao gồm tất cả các chất ngoài quy định của dược liệu đó như: đất, đá, rơm rạ, cây cỏ khác, các bộ phận khác của cây không quy định làm dược liệu, xác côn trùng...
Tiến hành: Theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 12.11) [2].
Cân chính xác khoảng 10 g hạt cần tây, dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp, dùng rây số 300 để phân tách tạp chất và dược liệu.