Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh: 161,95ºC.
Phổ tử ngoại: tiến hành đo phổ UV-VIS tại phòng Hóa phân tích –
Khoa Hóa học- Đại học Quốc gia Hà Nội, cho kết quả kháng sinh có các đỉnh hấp thụ tử ngoại ở: 208nm, 333nm và 442,5 nm. Từ đó, dự đoán cấu trúc KS có, nối đôi liên hợp, dị tố, hoặc kết hợp các đặc điểm trên. (PL1)
Phổ khối (PL3) : được tiến hành đo tại phòng phân tích cấu trúc phân
tử -Viện Hóa học – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, đo trên máy với độ phân giải cao, cho phép xác định con số chính xác tới 6 chữ số hàng thập phân. Kết quả dự đoán khối lượng phân tử của kháng sinh là 1291.697290 đvC. Trong phân tử kháng sinh có thể có chứa các nguyên tố như trong bảng 3.12 dưới đây. Bảng 3.12 : Kết quả dự đoán từ phổ MS. Các nguyên tố Khối lượng chính xác Số nguyên tử tối thiểu Số nguyên tử tối đa C 12,000000 0 80 H 1,007825 0 120 N 14,003074 0 6 O 15,994915 0 16 S 31,972071 0 4 Na 22,989770 0 1
Phổ hồng ngoại: (PL2) mẫu kháng sinh tinh khiết được tiến hành đo
độ hấp thụ hồng ngoại tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, cho thấy các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày trong bảng 3.13.
Bảng 3.13: Kết quả IR
Đỉnh hấp thụ
(cm-1) Nhóm chức đặc trưng
3346.03 Amin >NH hoặc - OH alcol bậc 3
2938.18 – CH2 - thẳng
2874.89 > C -H của ankan hoặc cyclo ankan vòng lớn 1668.68 > C = C < liên hợp
1742.91 liên kết >C = O của ceton hay ester béo 1583.45 liên kết trong muối amoni –NH3+
1369
CH3 - C(=O)-R hoặc - O – C –C < 1270.02
1195.79
1096.82 - C - O - C của ether béo
692.67 RHC = CHR (cis)
610.19
> C -X với X = Cl, Br. I 552.45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu, chúng tôi đã cơ bản hoàn thành được mục tiêu ban đầu của khóa luận tốt nghiệpvà rút ra một số kết luận cụ thể như sau:
1. Tiến hành ĐB cải tạo giống theo các phương pháp khác nhau có thể giúp tăng HTKS của KS được sinh tổng hợp bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces
155.16. 2.
Môi trường lên men chìm tốt nhất là MT1dt.
Kháng sinh thô thu được sau khi chiết từ dịch lọc và dịch lên men bằng dung môi ethylacetat ở pH = 7, được tách tốt nhất bằng sắc kí cột với hệ dung môi 3 (Butylacetat : ethanol : triethylamin (1: 2: 1)). Để thu được kháng sinh tinh khiết cần tiếp tục chạy sắc kí lần 2 với hệ dung môi ethylacetat : methanol (13:1) và lần 3 với hệ dung môi ethylacetat : n-hexan : methanol ( 13 : 10 : 1).
Có ít nhất 4 thành phần trong hỗn hợp kháng sinh thô. Hiệu suất tinh chế kháng sinh lần 1 là 57,01%.
3. Kháng sinh thứ nhất tinh khiết thu được có một số đặc điểm sau:
Kháng sinh có màu cam, tan tốt trong methanol, ethylacetat, butanol. Có phổ tác dụng rộng, trên cả vi khuẩn Gram (+) và Gram(-).
Trong dung môi methanol, kháng sinh hấp thụ ánh sáng tử ngoại cho
các đỉnh hấp thụ ở λ1 = 208nm, λ2 = 333nm và λ3 = 442,5nm. Như
vậy kháng sinh có thể chưa nối đôi liên hợp, có dị tố hoặc tổng hợp
các yếu tố trên.
Biện giải phổ hồng ngoại, sơ bộ dự đoán kháng sinh có thể có các nhóm chức : amin, acid carboxylic, ceton, ester, muối của amin bậc 3. Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh T0nc = 161,950C.
ĐỀ XUẤT
Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu hơn theo các hướng sau:
1. Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 155.16 (bằng UV, bằng hóa chất,
phương pháp đột biến bậc thang, kỹ thuật gen …) để tạo ra chủng có khả năng siêu sinh tổng hợp kháng sinh.
2. Nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về môi trường lên men để tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh; các điều kiện để tăng hiệu suất của từng kháng sinh trong hỗn hợp.
3. Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện chiết tách để thu được kháng sinh tinh khiết có hiệu suất cao hơn, dung môi an toàn.
4. Tiến hành biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR) kết hợp với các phổ khác để xác định cấu trúc kháng sinh tổng hợp được.
[1] Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2.
[2] Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến và ứng dụng trong định lượng kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật
[3] Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật
[4] Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr. 25-57.
[5] Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr. 39-67.
[6] Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Nữ Kim Thảo , Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Phân loại xạ khuẩn
http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm
[7] Bùi Thị Hà ( 2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất
kháng sinh chống nấm trên cây chè ở Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên, tr.3-16.
[8] Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược, NXB Y học, tập 2.
[9] Từ Minh Koóng (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y học, tập 2.
[10] Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp.
[11] Nguyễn Văn Thạch (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam, tr. 35-57.
[12] Cao Văn Thu (1998), Bài giảng về kháng sinh và vitamin.
[13] Cao Văn Thu, Trần Trịnh Công, Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Liên Hương, Nguyễn Lệ Phi, (2008), Vi sinh vật học, NXB Y học, Hà Nội.
[14] Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập 2.
[15] Nguyễn Thị Cẩm Vân (2011), Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.16, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Purification and Biological Activities”, American-Eurasian J. Agric. &
Environ. Sci., page. 368-377
[17] Kino T, Hatanaka H, Hasimoto M, Nishiyama M, Goto T, Okuhara M , Kohsaka M, Aoki H, Imanaka H (1987), FK-506, “A novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces. I. Fermentation, isolation, and physico-chemical and biological characteristics”, The Journal of antibiotics, vol XL , pages 1249 – 1255.
[18] Kekuda, T.R.P., K.S. Shobha and R. Onkarappa, (2010), Fascinating
diversity and potent biological activities of Actinomycete metabolites, J.
Pharm. Res., page 250-256.
[19] Mervyn Bibb and Andrew Hesketh (2009), “Analyzing the Regulation of Antibiotic Production in Streptomycetes”, Methods in Enzymology, Volume 458, page 93-116.
[20] Mohamed E. Osman, Fath Allah H. Ahmed, Walla S.M. Abd El All (2011), “Antibiotic Production from Local Streptomyces Isolates From Egyptian
Soil at Wady El Natron: Isolation, Identification and Optimization”,
Australian Journal of Basic and Applied Sciences, page. 782-792.
[21] Peter F. Stanbury (1988), Fermentation Technology, page 1-24.
[22] Rudi Emerson de Lima Procópio, Ingrid Reis da Silva, Mayra Kassawara Martins, João Lúcio de Azevedo, Janete Magali de Araújo (2012), “Antibiotics produced by Streptomyces”, The Brazilian Journal of Infectious
Diseases, 16(5), Pages 466–471.
[23] Skorska, C., J. Sitkowska, E. Krysińska-Traczyk, G. Cholewa and J. Dutkiewicz (2005), Exposure to airborne microorganisms, dust and endotoxin during processing of peppermint and chamomiles herbs in farms,
[25] Waksman, S.A.(1961), The Actinomycetes. Classification, identification and
description of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co.,
Baltimore, USA .
[26] Watve MG, Tickoo R, Jog MM, Bhole BD (2001), “How many antibiotics
are produced by the genus Streptomyces?”, Archives Microbiology, 176(5),
page 386-390.
[27] Weinberrg E.D. ( 1973) , “Secondary metabolism Control by temperature and inorganic phosphate” , Ind. Microbiol 15 , pages 1- 14.
thạch (VSV kiểm định : S. flexneri).
Hình P2: Kết quả thử HTKS dịch lên men chọn chủng bằng phương pháp giếng thạch (VSV kiểm định : S.flexneri).
