2.3.4. Xây dựng tiêu chuẩn thương phẩm Ba kích tím.
-Phân loại theo đƣờng kính của rễ
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT BA KÍCH TÍM TẠI BA CHẼ
3.1.1. Đặc điểm hình thái
Ba kích tím là cây bụi, thân leo. Thân non màu tím có lông, già chuyển sang màu xanh, cành non có cạnh. Lá mọc đối, hình mác, dày và cứng, mép lá nguyên, đỉnh nhọn, lúc non có lông dày hơn ở mặt dƣới, lá kèm nhỏ ôm sát vào thân. Hoa nhỏ màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, tập trung thành tán ở đầu cành. Đài hình chén hoặc hình ống, phát triển không đều. Tràng hàn liền ở phía dƣới thành ống ngắn, nhị 4, bầu hạ. Qủa hình cầu, rời hay hàn liền, mang đài tồn tại ở đỉnh, chín có màu đỏ. Rễ hình trụ tròn, cong queo, mặt ngoài màu nâu nhạt, có nhiều vân dọc và ngang, nhiều chỗ nứt ngang sâu tới lõi gỗ.
Hình 3.1. Cây Ba kích tím trồng tại Ba Chẽ 1. Cây Ba kích tím 3 năm tuổi 2, 3. Các bầu cây Ba kích tím giống
Hình 3.2. Cây Ba kích tím 2 năm tuổi và rễ
Dƣợc liệu ba kích tím sau khi đã phơi sấy khô đƣợc thể hiện trong hình 3.3
Hình 3.3. Rễ Ba kích khô.
Đối chiếu với khoá phân loại của Trung Quốc [26], Từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi [10], Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [12] và sự tƣ vấn
của TS. Nguyễn Quốc Huy, chúng tôi kết luận mẫu Ba kích tím ở Ba Chẽ là
Morinda officinalis How.
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu
Mẫu nghiên cứu là rễ Ba kích tím 2 năm tuổi.
Đặc điểm vi phẫu rễ Ba kích tím đƣợc thể hiện trong hình 3.4.
Hình 3.4. Đặc điểm vi phẫu rễ Ba kích tím
1. Bần, 2. Tinh thể canci oxalat,
3. Tế bào cứng, 4. Mô mềm,
5. Libe, 6. Tầng phát sinh libe -gỗ,
7. Gỗ
Quan sát vi phẫu rễ Ba kích tím đƣợc thu hái tại Ba Chẽ, Quảng Ninh (Hình 3.4) thấy có:
Mặt cắt dƣợc liệu hình tròn, từ ngoài vào trong có: bần gồm 4-9 lớp tế bào hình chữ nhật xếp thành vòng tròn đồng tâm và dãy xuyên tâm, trong tế bào thƣờng có các tế bào chứa bó tinh thế canxi oxalat hình kim, sát lớp bần có các tế bào mô cứng xếp liền nhau thành vòng. Mô mềm vỏ dày, cấu tạo bởi những tế bào thành mỏng, xếp lộn xộn, các tế bào ở phần ngoài bị ép bẹp. Phía trong mô mềm là libe, gồm các tế bào nhỏ tạo thành vòng liên tục. Rải rác trong mô mềm có chứa các bó tinh thể canci oxalat hình kim. Gỗ gồm các mạch gỗ lớn xếp thành bó, các bó xếp với nhau tạo thành lõi hình sao 5-6 cạnh.
3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu
Rễ đƣợc phơi sấy khô, tán thành bột mịn. Bột có màu nâu nhạt, vị chát, có mùi thơm dịu. Quan sát bột dƣới kính hiển vi (Hình 3.5), thấy có:
Mảnh bần gồm các tế bào hình chữ nhật (1)(2). Mảnh mô mềm cấu tạo bởi những tế bào hình nhiều cạnh thành mỏng (3). Sợi gỗ (9)(10). Tinh thể canxi oxalat hình kim (6)(7). Tinh bột (8)(11). Mảnh mạch điểm (12). Tế bào cứng (4)(5).
3.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
3.2.1. Sơ bộ tính tính các nhóm chất trong dược liệu Ba kích bằng các phản ứng hóa học.
3.2.1.1. Định tính glycosid tim
Cân khoảng 5g bột dƣợc liệu Ba kích tím cho vào bình nón dung tích 200ml. Thêm 100ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ có dung tích 100ml. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại, và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp Chloroform: Ethanol (4:1), mỗi lần với 8ml. Gạn dịch chiết Chloroform vào cốc có mỏ, loại nƣớc bằng natri sulfat khan. Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã đƣợc sấy khô và đem bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu đƣợc đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng của khung Steroid
Phản ứng Liebermann- Burchardat
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống nghiệm 45º. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Phản ứng dƣơng tính khi mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dƣới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh
Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5ml ethanol 90º. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussinat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% . Lắc đều.
Phản ứng dƣơng tính sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
Phản ứng Baljet: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (gồm 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) mới pha.
Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện màu đỏ da cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng của phần đường 2,6-desoxy Phản ứng Keller- Kiliani
Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5ml ethanol 90o. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ vài giọt dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều. Nghiêng ống nghiệm 45o cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Phản ứng dƣơng tính khi ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá.
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính.
Sơ bộ kết luận: trong rễ Ba kích tím có chứa glycosid tim.
3.2.1.2. Định tính alcaloid
Cân 1g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH= 9-10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng). Chiết alcaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nƣớc bằng natri sulfat khan, sau đó dùng làm phản ứng định tính.
Lấy một phần dịch chiết chloroform đã đƣợc chuẩn bị ở trên, đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nƣớc. Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lƣợt các thuốc thử sau:
Ống 1: Thuốc thử Mayer, phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện tủa màu từ trắng đến vàng.
Kết quả: dung dịch trong suốt Phản ứng âm tính.
Ống 2: Thuốc thử Bouchardat, phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện tủa màu từ nâu đến đỏ nâu.
Kết quả: dung dịch trong suốt Phản ứng âm tính.
Ống 3: Thuốc thử Dragendorff, phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện tủa màu từ vàng cam đến đỏ.
Kết quả: dung dịch trong suốt Phản ứng đều âm tính.
Sơ bộ kết luận: dƣợc liệu Ba kích tím không chứa alcaloid.
3.2.1.3. Định tính anthranoid
Phản ứng Borntraeger
Nguyên tắc phản ứng: Các hợp chất anthranoid khi tác dụng với kiềm (amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nƣớc.
Định tính anthranoid toàn phần
Lấy 2g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 100ml. Thêm 10ml dung dịch H2SO4 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi khoảng 15 phút. Lọc nóng dịch chiết qua giấy lọc vào bình gạn dung tích 50ml. Để nguội dịch lọc. Thêm 5ml chloroform, lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nƣớc, giữ lại lớp chloroform để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết chloroform, thêm 1ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ. Phản ứng dƣơng tính nếu lớp nƣớc sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp chloroform có màu vàng thì tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp chloroform sẽ mất màu còn lớp nƣớc thì màu sẽ đỏ đậm hơn.
Lấy 1ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp nƣớc sẽ có màu đỏ sim.
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính.
Định tính Anthranoid dạng tự do
Cho 2g bột rễ Ba kích tím vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm 10ml nƣớc cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua một lớp
bông mỏng vào bình gạn dung tích 50ml. Để nguội dịch lọc. Thêm 5ml chloroform. Lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nƣớc. Giữ lớp chloroform để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết chloroform vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ.
Kết quả: Lớp nƣớc chuyển sang màu đỏ sim Phản ứng dƣơng tính.
Vi thăng hoa
Trải bột dƣợc liệu thành một lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nƣớc. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nƣớc, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5-10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi.
Kết quả: Có xuất hiện tinh thể trên lam kính.
Sơ bộ kết luận: Trong rễ Ba kích tím có anthranoid.
3.2.1.4. Định tính flavonoid
Lấy 2g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết cồn, thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt). Để yên 1-2 phút. Phản ứng dƣơng tính khi dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Phản ứng với kiềm
Phản ứng với NH3: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã đƣợc mở nút. Phản ứng dƣơng tính khi thấy màu vàng của dịch chiết tăng lên. Nhỏ một giọt khác làm chứng.
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng với dung dịch NaOH: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết cồn. Phản ứng dƣơng tính nếu khi thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sẽ thấy xuất hiện
tủa vàng. Thêm 1ml nƣớc cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ đƣợc tăng thêm.
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết cồn. Thêm vào 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện tủa màu xanh đen.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Kết luận: Sơ bộ kết luận trong rễ Ba kích tím không có flavonoid.
Nhận xét: Phản ứng dƣơng tính với kiềm và FeCl3 nhƣng lại âm tính với cyanidin (đặc trƣng hơn) sơ bộ kết luận rễ Ba kích tím không chứa flavonoid.
3.2.1.5. Định tính coumarin
Lấy 2g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml enthanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng mở, đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml dịch chiết. Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%.
Ống 2: để nguyên.
Phản ứng dƣơng tính khi xảy ra các hiện tƣợng sau: - Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát
Ống 1: Có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng Ống 2: Trong
- Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nƣớc cất. Lắc đều rồi quan sát. Ống 1: Trong suốt
Ống 2: Có tủa đục
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại tủa đục nhƣ ống 2.
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính.
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vào giọt thuốc thử diazo. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện màu đỏ.
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính.
Quan sát hiện tượng huỳnh quang (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dƣới tác dụng của tia tử ngoại)
Nhỏ lên một khoanh giấy thấm 2 vết dịch chiết cồn (mỗi vết 2-3 giọt dịch chiết). Nhỏ 2-3 giọt dung dịch NaOH 5% lên 2 vết dịch chiết. Sấy nhẹ. Che một vết dịch chiết trên giấy thấm bằng một miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dƣới đèn tử ngoại.
Phản ứng dƣơng tính khi phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang nhƣ nhau.
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính.
Sơ bộ kết luận: có coumarin trong rễ Ba kích tím.
3.2.1.6. Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
Chiết 1g bột dƣợc liệu với 10ml nƣớc. Đun cách thủy trong vòng 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to. Thêm nƣớc cất đến 10ml. Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút. Để yên và quan sát cột bọt, thấy cột bọt bền trong 15 phút thì phản ứng dƣơng tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Hiện tượng phá huyết trên lam kính
Chiết 2g bột dƣợc liệu với ethanol 70% bằng cách đun hồi lƣu trong 30 phút rồi lọc. Cô bốc hơi dịch lọc cho đến cắn khô. Lấy 1 lƣợng cắn tƣơng đƣơng với 1g dƣợc liệu, đun nhẹ trên cách thủy để hòa tan với 10ml dung dịch đẳng trƣơng (dung dịch đệm phosphat đẳng trƣơng). Lọc, để nguội. Nhỏ một giọt máu (đã loại fibrin). Thêm 2-3 giọt dung dịch đệm , soi kính hiển vi (40 ) sẽ thấy rất rõ các hồng cầu
nguyên vẹn. Nhỏ tiếp trên lam kính 2-3 giọt dịch lọc. Quan sát hiện tƣợng vỡ hồng cầu qua kính hiển vi.
Kết quả: không thấy có hiện tƣợng vỡ hồng cầu trên kính hiển vi Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: trong rễ Ba kích tím không chứa saponin.
3.2.1.7. Định tính tanin
Lấy khoảng 1g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nƣớc cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc đƣợc dùng để định tính.
Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT). Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt.
Kết quả: không thấy xuất hiện tủa xanh đen hoặc xanh nâu nhạt Phản ứng âm tính.
Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch chì acetat 10% (TT). Phản ứng dƣơng tính sẽ xuất hiện tủa bông.
Kết quả: Có thấy xuất hiện tủa bông trắng Phản ứng dƣơng tính.
Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. Phản ứng dƣơng tính sẽ xuất hiện tủa bông trắng.
Kết quả: dung dịch có màu trong suốt, không xuất hiện tủa bông trắng Phản ứng âm tính.
Nhận xét: Phản ứng đặc trƣng của tanin là phản ứng gelatin, phản ứng này cho kết quả âm tính sơ bộ kết luận rễ Ba kích tím không có tanin.
3.2.1.8. Định tính đường khử
Cân khoảng 3g dƣợc liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 1ml nƣớc cất, đun sôi. Lọc qua giấy lọc vào một ống nghiệm khác. Thêm 1ml dung dịch thuốc thử Felling A và 1ml dung dịch Felling B. Đun cách thủy sôi vài phút. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện tủa đỏ gạch.
Kết quả: Thấy xuất hiện tủa đỏ gạch Phản ứng dƣơng tính.
3.2.1.9. Định tính polysaccharid
Cân khoảng 3g dƣợc liệu cho vào cốc có mỏ, thêm 20ml nƣớc cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào một ống nghiệm khác. Chia dịch chiết vào 3 ống nghiệm:
Ống 1: 4ml dịch chiết 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 2: 4ml nƣớc cất 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 3: 4ml dịch chiết
Phản ứng dƣơng tính nếu màu ở ống 1 đậm hơn ống 2 và ống 3.
Kết quả: Phản ứng dƣơng tính.
Sơ bộ kết luận: trong rễ Ba kích tím có chứa polysaccharid.
3.2.1.10. Định tính acid hữu cơ
Cân khoảng 3g bột dƣợc liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml nƣớc cất đem