. 2 P hn oại xạ khuẩn
3.1.Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn từ đất trồng trọt tại Minh Trí, Sóc Sơn,
2. Hóa chất, thiết b
3.1.Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn từ đất trồng trọt tại Minh Trí, Sóc Sơn,
Sơn, Hà Nội
3.1.1. ập ạ k uẩ từ đất trồ g trọt tại Mi Tr , Só Sơ , Hà Nội
Minh Trí là xã có địa giới phía Bắc giáp xã Bắc Sơn và tỉnh Vĩnh Phúc, phía Nam giáp xã Tân Dân, phía Đông giáp phướng Xuân Hòa ( thị xã Phúc Yên, Vĩnh Phúc), phía Tây giáp xã Minh Phú và Nam Sơn. Minh Trí có tổng diện tích đất tự nhiên là 2435,37 ha, trong đó đất sản xuất nông nghiệp chỉ có 405,99 ha, chiếm 16,7% diện tích đất tự nhiên. Địa bàn xã là vùng đồi gò, đất bạc màu. Khí hậu nơi đây mang đầy đủ đặc điểm của khí hậu vùng đồng bằng Sông Hồng nóng ẩm ôn hòa và chịu ảnh hưởng khí hậu trung du bắc bộ. Nhiệt độ trung bình hàng năm khoảng 28- 29oC, số giờ nắng trung bình khá dồi dào với 1645 giờ chế độ mưa gắn liền với sự thay đổi theo mùa và đạt mức trung bình hàng năm là 1.600 - 1700 mm. Mùa mưa tập trung từ tháng 4 đến tháng 10, độ ẩm không khí trung bình 84%.
Từ các mẫu đất lấy ở các độ sâu khác nhau theo thứ tự 0cm, 5cm, 10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm tại các địa điểm khác nhau thuộc khu vực đất trồng trọt xã Minh Trí, Sóc Sơn, Hà Nội, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 12 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Tiến hành phân lập xạ khuẩn trên môi trường nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn trong đất có khả năng phân giải cellulose,thu được 12 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn chi Streptomyces trong trồng trọt khu vực Minh Trí, Sóc Sơn, Hà Nội có khả năng phân giải cellulose mạnh.
23 Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt STT Độ sâu Độ pha loãng Môi trƣờng Gause I Czapeck – glucose Czapeck - Tinh bột 1 0 cm 10-5 S1, S2 10-6 2 5 cm 10-5 S3 S11 10-6 S4 3 10 cm 10-5 S5, S6 10-6 4 15 cm 10-5 10-6 S7 5 20 cm 10-5 S8 10-6 6 25 cm 10-5 S9 S12 10-6 7 30 cm 10-5 S10 10-6
Trên 3 môi trường Gause I, Czapeck, Czapeck- tinh bột cả xạ khuẩn, nấm mốc và một số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại VSV này đều có khả năng phân giải cellulose. Nhưng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này:
Khuẩn lạc vi khuẩn thường nhày, ướt và nhẵn.
Khuẩn lạc xạ khuẩn cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc nẩm mốc nhưng khác ở chỗ chúng phát triển chậm và nhỏ hơn khuẩn lạc nấm mốc nhiều lần. Khuẩn lạc xạ khuẩn thì bông, xốp, khô, rắn chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, nhìn kỹ có dạng sợi nấm nhưng đường kính sợi bé
24
hơn sợi nấm rất nhiều chỉ bằng 1 đến 2 phần 10 đường kính sợi nấm, nếu không có HSKS thì khuẩn lạc có dạng màng dẻo.
Sau 3 ngày phát triển khuẩn lạc xạ khuẩn có kích thước khoảng 0,5 - 2mm. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn theo tiêu chuẩn: có sự bông, xốp, khô, có màu đặc trưng, nhìn kỹ có dạng sợi nấm, có thể có dạng phóng xạ, có thể có vòng vô khuẩn bao quanh, khuẩn lạc to.
Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn có khuẩn lạc dạng tròn, dày, bông, xốp, có màu sắc đa dạng. Phần lồi ra khỏi bề mặt môi trường chính là phần HSKS, phần này có những cuống sinh bào tử nên làm cho khuẩn lạc bông, xốp. Phần bám chặt vào môi trường thạch chính là phần HSCC, phần này rất khó tách ra. Khi sử dụng que cấy để cấy truyền sang môi trường thạch nghiêng thì chỉ lấy được phần HSKS còn phần HSCC vẫn nằm trên môi trường thạch.
Hình 3.1. Khuẩn lạc của xạ khuẩn phân lập đƣợc từ đất trồng trọt tại Minh Trí, Sóc Sơn, Hà Nội
Qua kết quả phân lập xạ khuẩn trong trồng trọt khu vực Minh Trí, Sóc Sơn, Hà Nội thu được sau:
Phân lập được 12 chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose. Môi trường Gause I là môi trường phân lập được nhiều chủng xạ khuẩn nhất (10 trong số 12 chủng), đây là môi trường thích hợp nhất với sự phát triển của xạ khuẩn nên khuẩn lạc xạ khuẩn mọc trên môi trường này nhiều hơn 2 môi
25
trường Czapeck và Czapeck- tinh bột, vì thế ta phâp lập được nhiều xạ khuẩn từ môi trường này.
Xạ khuẩn là loại VSV hoại sinh, hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25- 30oC, độ ẩm thích hợp từ 40-50%, độ pH trung tính hoặc kiềm nhẹ. Ở độ sâu 0cm, 5cm, 10cm có những điều kiện tối ưu về độ tơi xốp, thoáng khí, giàu chất hữu cơ, có pH, độ ẩm ... thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn vì thế số chủng xạ khuẩn phân lập được từ 3 độ sâu này là nhiều nhất.
Như vậy, số chủng xạ khuẩn ph n ập được từ 7 độ s u cùng v i 3 môi trường từ đất trồng trọt tại Minh Tr , Sóc Sơn, Hà Nội à 2 chủng xạ khuẩn, trong đó 0 chủng thu được từ môi trường Gause I và ở độ s u 0cm, 5cm, 0 cm số chủng ph n ập được cũng nhiều nhất.
3.1.2. Tuyể ọ ạ k uẩ từ đất trồ g trọt tại Mi Tr , Só Sơ , Hà Nội
3.1.2.1. Đặc điểm khuẩn ạc của các chủng xạ khuẩn
Tiến hành nghiên cứu đặc điểm hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất... của các chủng xạ khuẩn đã phân lập được. Nuôi cấy các chủng này trên môi trường Gause I, sau 3 – 5 ngày đem quan sát. Khuẩn lạc xạ khuẩn dạng tròn, dày, bông, xốp. Phần lồi ra khỏi bề mặt môi trường chính là phần HSKS có những cuống sinh bào tử làm cho khuẩn lạc bông, xốp; phần bám chặt vào môi trường thạch chính là HSCC rất khó tách ra. Khi sử dụng que cấy để cấy truyền khuẩn lạc sang ống thạch nghiêng thì chỉ lấy được phần HSKS còn phần HSCC vẫn nằm trên môi trường thạch. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 .
26
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
STT Chủng xạ khuẩn Màu sắc khuẩn lạc HSKS HSCC 1 S1 Xám Xám xanh 2 S2 Trắng Nâu nhạt 3 S3 Xám Vàng 4 S4 Nâu Vàng 5 S5 Hồng Vàng oliu 6 S6 Xám Vàng xỉn 7 S7 Trắng Vàng 8 S8 Xám Xám 9 S9 Hồng Đỏ gạch 10 S10 Xanh Xanh đậm 11 S11 Trắng Hồng nhạt 12 S12 Xám Vàng
Từ 12 chủng xạ khuẩn phân lập được, chúng tôi nhận thấy màu sắc HSKS rất đa dạng. Có 5 nhóm màu xuất hiện với số lượng và tỷ lệ khác nhau, được thể hiện trên bảng 3.3, hình 3.2 và 3.3.
Bảng 3.3. Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu
STT Nhóm màu Số lƣợng chủng phân lập đƣợc Tỷ lệ (%) 1 Xám (Grey) 5 41.7 2 Trắng (White) 3 25.0 3 Hồng (Pink) 2 16.7 4 Nâu (Brown) 1 8.3 5 Xanh (Blue) 1 8.3 Tổng 12 100
27
Từ kết quả trên bảng 3.3 cho thấy, tuy các chủng xạ khuẩn phân lập được rất đa dạng về màu sắc nhưng tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc nhóm màu xám chiếm ưu thế chiếm 41.7%, tiếp đó là nhóm trắng chiếm 25.0 %, các nhóm hồng chiếm 16.7%, nâu, xanh chiếm tỷ lệ thấp 8.3%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả này rất phù hợp với kết quả của một số tác giả như Lê Thị Hương Giang khi tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập ở núi Pháo, Đại Từ, Thái Nguyên , và Bùi Thị Hà nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên, luân văn thạc sĩ cũng nhận thấy nhóm màu xám là chiếm ưu thế. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của tác giả Hoàng Mai Linh khi phân lập xạ khuẩn từ đất tại Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc thì nhận thấy màu trắng chiếm ưu thế hơn, sau mới đến màu xám và các nhóm màu khác. Sự khác biệt này có thể do tính chất của đất, các vùng đất khác nhau có điều kiện tự nhiên như: độ ẩm, độ màu mỡ, độ thoáng khí khác nhau nên các vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng có sự đa dạng về màu sắc khác nhau.
Đất là môi trường tốt nhất cho xạ khuẩn phát triển, cùng một loại đất ở các độ sâu khác nhau sự phân bố của xạ khuẩn là khác nhau và không thể đưa ra một quy luật chung nào cho sự phân bố của xạ khuẩn cho nhóm màu. Chính vì vậy, trước đây màu sắc hệ khuẩn ty xạ khuẩn được coi là những chỉ tiêu cơ bản để phân loại xạ khuẩn, nhưng do xạ khuẩn có tính biến dị cao nên các đặc điểm hình thái, tính chất nuối cấy thường có giá trị thấp về mặt phân loại.
28 0 10 20 30 40 50 Tỷ lệ Xám (Grey) Trắng (White) Hồng (Pink) Nâu (Brown) Xanh (Blue) Nhóm màu
Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu
Tỷ lệ (%)
Hình 3.2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu
Hình 3.3. Một số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
Nhận thấy, các chủng xạ khuẩn ph n ập được rất đa dạng về màu sắc nhưng tỷ ệ các chủng xạ khuẩn thuộc nhóm màu xám chiếm ưu thế. Các vùng đất khác nhau có điều kiện tự nhiên khác nhau vì thế xạ khuẩn có sự đa dạng về màu sắc khác nhau.
3.1.2.2.Nghiên cứu sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn đã ph n ập
HSCC mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào môi trường, HSCC có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung cấp chất dinh dưỡng cho toàn bộ cơ thể. Tùy loại môi trường mà HSCC có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố
29
trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước có sắc tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ.
Việc nghiên cứu sắc tố tan giúp ta có thêm cơ sở để phân loại xạ khuẩn, mỗi loài xạ khuẩn có sắc tố tan khác nhau và đặc trưng cho mỗi loài. Ngoài ra sắc tố tan còn liên quan đến khả năng sinh kháng sinh và sinh emzyme của xạ khuẩn, nếu sắc tố tan mạnh chứng tỏ xạ khuẩn sinh trưởng tốt, từ đó khả năng sinh kháng sinh và đặc biệt là cellulase sẽ cao hơn.
Tiến hành nghiên cứu sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn đã phân lập được. Nuôi cấy các chủng này trên môi trường Gause I, sau 3 – 5 ngày đem ra quan sát. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Đặc điểm sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
STT Chủng xạ khuẩn Sắc tố tan 1 S1 Không có 2 S2 Không có 3 S3 Vàng nhạt 4 S4 Da cam 5 S5 Vàng 6 S6 Nâu 7 S7 Vàng nhạt 8 S8 Đen 9 S9 Trắng đục 10 S10 Xanh 11 S11 Vàng nhạt 12 S12 Không có
Từ bảng trên nhận thấy trong các chủng xạ khuẩn phân lập được có 9 chủng có khả năng hình thành sắc tố tan: S3,S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S11
30
chiếm 75.0 % còn lại 3 chủng không sinh sắc tố tan đó là: S1, S2, S12 chiếm 25.0 %.
Hình 3.4. Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
Sắc tố tan là sắc tố khuếch tán vào môi trường nuôi cấy của xạ khuẩn tùy vào xạ khuẩn phân lập từ loại đất nào, nuôi cấy trên môi trường nào mà có khả năng sinh sắc tố tan khác nhau. Màu sắc sắc tố tan của các chủng xa khuẩn rất phong phú như: chủng S6 có màu nâu, S4 có màu da cam, S5 có màu vàng, S9 có màu trắng đục, S8 có màu đen, S10 có màu xanh ...
Qua kết quả nghiên cứu thấy, trong 2 chủng xạ khuẩn ph n ập được có 9 chủng có khả năng hình thành sắc tố tan, 3 chủng không sinh sắc tố tan. 3.1.2.3. Xác đ nh khả năng sinh ce u ase của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Trong quá trình sống, xạ khuẩn cần tổng hợp nên các emzyme. Các emzyme được hình thành trong tế bào và một số tiết ra môi trường xung quanh. Trong sản xuất emzyme từ xạ khuẩn chủ yếu là thu nhận các emzyme
31
ngoại bào. Không phải tất cả vi sinh vật đều có khả năng sinh emzyme như nhau, vì vậy, khi tuyển chọn các chủng giống phải tiến hành phân lập, kiểm tra và lựa chọn các chủng có hoạt tính emzyme mạnh, sinh nhiều emzyme mong muốn tùy theo mục đích.
Từ các chủng xạ khuẩn phân lập đem đi thử hoạt tính enzyme cellulase trên môi trường chứa 1% CMC và 1% bột giấy. Thu được kết quả trình bày ở bảng 3.5 và 3.6.
Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa CMC STT Chủng xạ khuẩn Đường kính lỗ khoan D (mm) Đường kính vòng phân giải D (mm) Hoạt tính D – d (mm) 1 S1 10 21 ± 0,12 11 ± 0,12 2 S2 10 22 ± 0,15 12 ± 0,15 3 S3 10 28 ± 0,23 18 ± 0,23 4 S4 10 24 ± 0,21 14 ± 0,21 5 S5 10 23 ± 0,15 13 ± 0,15 6 S6 10 32 ± 0,23 22 ± 0,23 7 S7 10 23 ± 0,18 13 ± 0,18 8 S8 10 25 ± 0,33 15 ± 0,33 9 S9 10 30 ± 0,22 20 ± 0,22 10 S10 10 25 ± 0,26 15 ± 0,26 11 S11 10 28 ± 0,16 18 ± 0,16 12 S12 10 22 ± 0,57 12 ± 0,57
32
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa bột giấy
STT Chủng xạ khuẩn Đường kính lỗ khoan D (mm) Đường kính vòng phân giải D (mm) Hoạt tính D – d (mm) 1 S1 10 20 ± 0,22 10 ± 0,22 2 S2 10 22± 0,45 12 ± 0,45 3 S3 10 27 ± 0,36 17 ± 0,36 4 S4 10 22 ± 0,16 12 ± 0,16 5 S5 10 23 ± 0,42 13 ± 0,42 6 S6 10 31 ± 0,33 21 ± 0,33 7 S7 10 22 ± 0,58 12 ± 0,58 8 S8 10 28 ± 0,15 18 ± 0,15 9 S9 10 28 ±0,61 18 ± 0,61 10 S10 10 25 ± 0,34 15 ± 0,34 11 S11 10 23 ± 0,78 13 ± 0,78 12 S12 10 21 ± 0,65 11 ± 0,65 Mức độ hoạt tính: Rất mạnh D – d ≥ 30mm Mạnh 20mm ≤ D – d < 30mm Trung bình 0mm ≤ D – d < 20mm Yếu D – d <10mm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tất cả 12 chủng nghiên cứu đều có hoạt tính cellulase. Trong đó trên môi trường CMC có 2 chủng S6, S9 có mức độ hoạt tính mạnh, đường kính phân giải cellulose của S6 là 22, S9 là 20, còn lại 10 chủng có mức độ hoạt tính trung bình, đường kính phân giải cellulose từ 10 -18 mm. Còn trên môi trường bột giấy chủng S6 là có mức độ hoạt tính cellulase mạnh nhất là 21 mm, còn lại 11 chủng có mức độ hoạt tính trung bình.
33
Chủng S6 có hoạt tính cellulase mạnh nhất, ngoài ra chủng S9 cũng có hoạt tính cellulase khá mạnh trên cả hai môi trường nuôi cấy có chứa CMC và bột giấy. Điều này chứng tỏ các chủng Streptomyces phân lập được có khả năng sinh cả enzyme endogluconase và exogluconase. Đó là do nguồn cacbon hữu cơ trong đất chủ yếu là cellulose tự nhiên, có mức độ kết tinh cao khó phân giải.
Hai chủng xạ khuẩn S6, S9 đều phân lập trên môi trường Gause I cho thấy các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng và nuôi cấy trên môi trường Gause I đều có khả nảng sinh cellulase cao, vì đất trồng trọt và môi trường Gause I có đầy đủ các điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm, độ pH, thành phần dinh dưỡng... cho sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn.
Điều này giúp cho chúng tận dụng tốt nguồn dinh dưỡng ngoài môi trường để sinh trưởng và phát triển. Đồng thời còn có ý nghĩa rất lớn về mặt sinh thái giúp cho việc phân hủy nhanh các hợp chất khó tiêu thụ trong đất (xác thực vật, động vật...) thành các chất đơn giản dễ hấp thụ, làm nguồn thức ăn chính của nhiều loài động vật, thực vật.
34
Hình 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Tóm ại, đã tuyển chọn được 2 chủng có khả năng sinh ce u ase mạnh là S6 và S9 trong tổng số 2 chủng xạ khuẩn ph n ập được từ đất trồng trọt từ Minh Tr , Sóc Sơn, Hà Nội nhằm ứng dụng vào việc xử rác thải.