1. 4.1 Hemagglutinin (HA)
2.3. Phƣơng phỏp nghiờn cứu:
2.3.1. Tỏch chiết RNA tổng số
Virus đƣợc bất hoạt bằng trizol với tỷ lệ 1:1 bằng xy lanh trộn đều
Bổ sung dung dịch chlorophorm vào huyền dịch virus đó đƣợc bất hoạt trong trizol, đảo đều trong khoảng 1 giõy.
Lƣu giữ ở nhiệt độ phũng trong 5 phỳt, li tõm 10.000v/p trong 10 phỳt.
Chuyển pha trờn vào ống efpendof mới.
Bổ sung 0,5ml isopropanol. Đảo đều để ở nhiệt độ phũng trong 15 phỳt.
Li tõm 12.000v/p trong 30 phỳt tại 40C để thu tủa RNA.
Rửa tủa bằng 1 ml ethanol 70%, li tõm 12.000v/p trong 15 phỳt ở 40C.
Làm khụ RNA trong box, hũa lại mẫu với 20 ml nƣớc vụ trựng đó loại RNAse.
2.3.2 Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế.
Nguyờn tắc: dựa vào sự hấp phụ ỏnh sỏng tia tử ngoại ở bƣớc súng 260 nm của cỏc bazơ nito là purin và pirimidin.
Nồng độ RNA sợi đơn (àg/ ml) đƣợc tớnh theo cụng thức: CRNA = A260 x 40 x d
Với d là độ pha loóng mẫu cần đo. Cỏch tiến hành:
Pha loóng dung dịch ARN 20 lần trong nƣớc vụ trựng ( 5 àl dung dịch ARN trong 95 àl H2O.
Chuyển dung dịch ARN đó pha loóng sang ống thạch anh của mỏy quang phổ Shimadzu và đo ở bƣớc súng 260 nm
Nồng độ của mẫu đo đƣợc tớnh theo cụng thức trờn với độ pha loóng 20 lần.
2.3.3 Tổng hợp cDNA
Nguyờn tắc: tổng hợp cDNA từ RNA của virus H1N1 cần cú enzym phiờn mó ngƣợc reverse transcriptase và mồi ngẫu nhiờn radom primer.
Cỏch tiến hành:
Chuẩn bị hỗn hợp RNA và mồi trong ống efpendof vụ trựng với cỏc thành phần:
RNA tổng số (30 – 50 ng) : 5 àl Mồi ngẫu nhiờn (50ng/ àl) : 3 àl dNTP (10mM) : 1 àl H2O khụng cú RNAse : 1 àl Tổng thể tớch : 10 àl
Hỗn hợp đƣợc ủ ở 650
C trong 5 phỳt rồi đặt trờn đỏ ớt nhất trong 1 phỳt. Trong thời gian chờ sẽ chuẩn bị tiếp những thành phần khỏc để bổ sung cho phản ứng.
10 X RT buffer : 2 àl
25 mM MgCl2 : 4 àl 0,1M DDT : 2 àl Chất ức chế RNase : 1 àl (RNase out recombinant ribonuclease inhibitor) Tổng thể tớch : 9 àl
Bổ sung 9 àl hỗn hợp thành phần trờn vào mỗi ống chứa RNA và mồi đó xử lớ ở 650 C trong 5 phỳt , đảo nhẹ, li tõm 3000v/p trong 30 giõy.
Ủ phản ứng ở 250
Bổ sung 1àl enzyme phiờn mó ngƣợc ( SuperScriptTMII RT) vào mỗi phản ứng, đảo đều sau đú ử tiếp ở chu trỡnh nhiệt trong mỏy PCR nhƣ sau:
250 C trong 10 phỳt 400 C trong 50 phỳt 700 C trong 15 phỳt Bảo quản ở 40 C
Bổ sung 1àl Rnase H vào mỗi ống và ử ở 370
C trong 20 phỳt để loại bỏ hoàn toàn RNA. Mẫu sau đú chỉ cũn cỏc sợi cDNA cú kớch thƣớc khỏc nhau, cỏc cDNA này sẽ dựng làm khuụn tổng hợp cỏc DNA đặc hiệu bằng phƣơng phỏp PCR.
2.3.4. Nhõn gen M1 của virus cỳm A/H1N1 bằng PCR
cDNA của virus cỳm A/H1N1 đƣợc sử dụng làm khuụn để nhõn dũng gen mó húa protein M1 với cặp mồi đặc hiệu M1pBac-F và M1pBac-R đƣợc thiết kế dựa trờn trỡnh tự gen M1 cụng bố trờn Genbank, với trỡnh tự nhƣ sau:
M1pBac-F: 5’-ATC GGA TCC GGT CAT GGA GGA TGG GTC TTC TTA CCG- 3’ BamH I trỡnh tự Kozak
M1pBac-R: 5’ - TCG GAA GCT TTC ACT TGA ATC GCT GCA TC - 3’
HindIII
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tớch 25 àl bao gồm:
H2O :16,2 àl Buffer : 2,5 àl dNTP : 2,0 àl FP (mồi xuụi) : 1,0 àl RP (mồi ngƣợc) : 1,0 àl Template : 1,0 àl Taq pol : 0.3 àl
Tổng thể tớch : 25 àl Chƣơng trỡnh PCR đƣợc tiến hành theo cỏc bƣớc:
Bƣớc 1: 940C trong 2 phỳt Bƣớc 2: 940 C trong 30 giõy Bƣớc 3: 580C trong 40 giõy Bƣớc 4: 720C trong 1phỳt Bƣớc 5: 720 C trong 8 phỳt
Lặp lại 30 chu kỡ bắt đầu từ bƣớc 2, giữ ở 40C cho đến khi phõn tớch. Sản phẩm PCR (hộp gen M1), là gen M1 cú gắn thờm trỡnh tự Kozak và mó khởi đầu ở đầu 5’ và mó kết thỳc ở đầu 3’ và vị trớ nhận biết của 2 enzym cắt giới hạn tƣơng ứng là BamHI và HindIII, đƣợc tinh sạch qua kit tinh sạch PCR (Fermentas, Đức) và gắn vào vector tỏch dũng pCR2.1 tạo lờn plasmid tỏi tổ hợp pCRM1.
2.3.5. Điện di trờn gel agarose
Húa chất điện di: agarose 1% (1g agarose pha trong 100ml dung dịch TAE 1X); dung dịch đệm TAE 50X (60,5g Tris base; 14,3ml acid acetic; 25ml EDTA 0,5M, pH 8,0); ethidium bromide (EtBr) 10mg/ml; đệm tra mẫu 10X (0,1ml bromophenol blue 10%; 0,3% glyxerol 100% và định mức bằng H2O đến 1ml).
Chuẩn bị gel agarose 1%: cho 1 g agarose vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun trong lũ vi súng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 500C, đổ dung dịch vào khay điện di cú cài sẵn răng lƣợc. sau khoảng 30 phỳt khi gel đó đụng, gỡ lƣợc raddawth gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X vào dung dịch ngập cỏch mặt gel 1 -2 mn.
Tra mẫu: Lấy khoảng 5 àl sản phẩm trộn với 3 àl màu loadingdye 10X (bromophenol blue) tra vào cỏc giếng nhỏ trong gel. Chạy điện di ở hiệu điện thế ổn định 100 V, cƣờng độ dũng điện 400 mA, thời gian khoảng 25 – 30 phỳt. DNA sẽ di chuyển từ cực õm sang cực dƣơng. Dựa vào sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào ngừng điện di.
Nhuộm DNA bằng ethydium bromide. Đõy là hợp chất húa học cú khả năng gắn xen vào giữa cỏc bazonito của acidnucleic, sẽ phỏt màu huỳnh quang dƣới tỏc dụng của tia tử ngoại [1]. Bản gel đƣợc lấy, trỏng qua nƣớc rồi quan sỏt và chụp ảnh dƣới ỏnh sỏng tia tử ngoại của mỏy soi chụp gel.
2.3.6 Tỏch dũng gen
Gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tỏch dũng pCR2.1 sử dụng bộ sinh phẩm của hóng Invitrogen. Phản ứng đƣợc thực hiện với thành phần:
H2O : 5 àl
Bufer for T4 – Ligase : 1 àl Sản phẩm PCR : 2 àl Enzym (T4 – Ligase) : 1 àl Vector ( pCR) : 1 àl Tổng thể tớch : 10àl
Ủ mẫu ở nhiệt độ 40C trong 1 giờ. Sản phẩm lai sau đú đƣợc biến nạp vào tế
bào E.coli DH5α. Cấy trải trờn mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung Amp và X- gal, sau đú ủ
ở 370C qua đờm. Cỏc khuẩn lạc E. Coli chứa vector tỏi tổ hợp mang sản phẩm PCR sẽ cú màu trắng.
2.3.7. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli
Cơ chế biến nạp bao gồm việc làm thay đổi cấu trỳc thành tế bào vi khuẩn để DNA plasmid dễ dàng chui vào tế bào thể nhận. Những tế bào cú khả năng tiếp nhận DNA- plasmid ngoại lai đƣợc gọi là tế bào khả biến. Quỏ trỡnh biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli gồm 2 giai đoạn:
Tạo tế bào khả biến:
Tế bào E.coli đƣợc nuụi qua đờm trong 5ml mụi trƣờng LB lỏng.
Pha loóng huyền dịch tế bào đó nuụi cấy theo tỷ lệ 1:100 trong 5ml mụi trƣờng LB.
Nuụi lắc ở 37°C, 200v/phỳt. Sau 2 giờ tiến hành kiểm tra mật độ tế bào bằng phƣơng phỏp quang phổ kế ở bƣớc súng 600nm. Khi giỏ trị OD600 đạt từ 0,6 – 1 là đạt yờu cầu.
Chuyển 1ml dịch tế bào sang ống eppendorf vụ trựng.
Để trờn đỏ 10 phỳt. Sau đú ly tõm thu sinh khối ở 4°C, tốc độ 4.000v/phỳt, trong thời gian 10 phỳt; loại dịch nổi.
Rửa cặn tế bào bằng CaCl2 100mM (tỷ lệ 1:10) ở 4°C. Ly tõm 4.000v/phỳt, loại dịch nổi.
Rửa lại bằng CaCl2 100mM ( tỷ lệ 1:20) ở 4°C; ly tõm thu cặn.
Hũa cặn tế bào thành huyền dịch trong 100àl CaCl2 100mM, giữ trong đỏ ớt nhất 1 giờ trƣớc khi tiến hành biến nạp.
Biến nạp:
Bổ sung 3-4àl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến.
Để trờn đỏ trong 30 phỳt.
Sốc nhiệt ở 42°C trong 1phỳt 30 giõy.
Chuyển ống tế bào vào trong đỏ xốp để 3 phỳt.
Bổ sung 250àl mụi trƣờng LB lỏng; nuụi lắc ở 37°C trong 1 giờ.
Cấy trải 100àl-150àl trờn mụi trƣờng thạch LBA (mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung Amp(100àg/ml)).
Ủ đĩa đó cấy trong tủ ấm 37°C qua đờm.
2.3.8. Tỏch chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli
Để thu nhận plasmid tỏi tổ hợp, DNA plasmid đƣợc tỏch chiết lại từ tế bào vi khuẩn đó biến nạp và kiểm tra bằng cỏch cắt với enzym giới hạn. Quỏ trỡnh tỏch chiết gồm cỏc bƣớc cơ bản: phỏ màng; loại protein; tủa nucleic acid.
Cấy cỏc khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh vào 2ml mụi trƣờng LBA. Nuụi lắc qua đờm ở 37°C, 200v/phỳt
Ly tõm hỗn hợp dịch tế bào đó biến nạp 12.000v/p trong 1 phỳt; loại dịch nổi và thu cặn
Bổ sung Sol I (Tris-HCl 50mM, pH 8,0 + EDTA 10mM, pH8,0) và trộn đều bằng mỏy vortex
Bổ sung Sol II (NaOH 200mM + SDS 1%), đảo nhẹ bằng tay
Bổ sung Sol III (Kac-Potasium Acetat 3M, pH 5,5), đào nhẹ bằng tay
Chiết bằng chloroform: isomylalcohol (24:1); đảo nhẹ
Ly tõm 12.000 v/p trong 15 phỳt
Thu dịch nổi, tủa bằng muối NAOAC 3M (1/10 thể tớch) và Ethanol 100% (2,5 thể tớch) ở -20°C ớt nhất trong 1 giờ
Ly tõm 12.000v/phỳt trong 20 phỳt; loại bỏ dịch nổi thu cặn
Rửa cặn bằng Ethanol 70%
Làm khụ cặn và hũa tan lại trong dung dịch TE-RNase (100àg/ml)
Ủ trong bể ổn nhiệt 37°C trong 1 giờ để loại RNA
Điện di kiểm tra trờn gel agarose 1%.
2.3.9. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
Trong quy trỡnh, chỳng tụi tiến hành phƣơng phỏp này nhằm kiểm tra vector pCR2.1 và dũng plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO cú mang hộp gen M1 hay khụng. Vector pCRM1 và pBluBacM1 tỏi tổ hợp mang hộp gen M1 đƣợc chọn lọc bằng cỏch cắt kiểm tra với 2 enzym là BamH I và Hind III.
Phản ứng cắt vector biểu hiện tỏi tổ hợp với enzym giới hạn gồm: H2O khử ion vụ trựng : 3,5 àl
Dung dịch đệm cho enzym (buffer 3) : 1,0 àl
BSA : 0,1 àl
Enzym giới hạn (EcoRI; BamH I; Xho I) : 0,4 àl DNA plasmid : 5,0 àl
Tổng thể tớch : 10 àl
Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 4 giờ. Sản phẩm phản ứng đƣợc kiểm tra bằng điện di trờn gel agarose 1%. Trỡnh tự và cấu trỳc và hộp gen M1 trong pCRM1 và pBluBacM1 sau khi cắt kiểm tra bằng enzym cắt giới hạn đƣợc khẳng định lại bằng đọc trỡnh tự DNA nhờ hệ thống đọc trỡnh tự tự động ABI PRISMđ 3100 (Applied Biosystems, Mỹ). Cỏc dũng plamid tỏi tổ hợp mang gen M1 đƣợc tỏch lƣợng lớn và bảo quản ở -200C để sử dụng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
2.3.10. Thu đoạn DNA từ gel agarose
Để thu đoạn DNA từ gel agarose, chỳng tụi sử dụng bộ sinh phẩm kit Bioneer. Quỏ trỡnh này gồm cỏc bƣớc cơ bản:
Lấy mẫu chạy điện di trờn gel agarose 1% cựng loading dye
Thu băng DNA cần quan tõm: đƣa bản gel lờn soi trờn tia cực tớm, cắt bDNA mong muốn, đƣa vào ống effpendop cõn xỏc định trọng lƣợng, bổ sung dung dịch thụi gel theo tỷ lệ 1:1
Ủ ở nhiệt độ 55 0 C trong 10 phỳt, đảo nhẹ cho gel tan hoàn toàn.
Li tõm 1000 vũng / phỳt
Gắn DNA lờn cột
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tỏch chiết RNA tổng số
Cỏc phõn tử RNA khụng bền, dễ bị phõn hủy bởi cỏc enzym cú bản chất là cỏc ribonuclease (RNase). Hơn nữa cỏc RNase lại cú mặt ở nhiều nơi nhƣ mồ hụi, tay ngƣời thao tỏc…. Vỡ vậy việc tỏch chiết RNA đũi hỏi nhiều biện phỏp thận trọng để trỏnh nhiễm RNase từ mụi trƣờng ngoài vào mẫu. Thao tỏc trong điều kiện vụ trựng, mọi dụng cụ húa chất đều đƣợc xử lớ bằng DEPC sau đú đƣợc khử trựng bằng nhiệt độ và ỏp suất cao, khi thao tỏc phải đeo găng tay…
RNA trong nghiờn cứu sinh học đũi hỏi phải cú độ tinh sạch cao (khụng lẫn protein, DNA). Để đo nồng độ và độ tinh sạch RNA cần dựng cho việc tạo cDNA chỳng tụi sử dụng phƣơng phỏp quang phổ kế xỏc đinh độ hấp phụ tại bƣớc súng 260nm (A260). Kết quả trỡnh bày tại bảng dƣới:
A260
(độ pha loóng 20 X)
Cụng thức tớnh Tỷ lệ A260/A280 Nồng độ RNA
0,13 0,13 x 40 x 20 1,87 104 μg/ml
Ở bảng trờn cho thấy, ƣớc tớnh cú 104 ng trong 1 àl dung dịch RNA đó tỏch chiết. RNA cú độ tinh sạch cao đủ điều kiện cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
3.2. Thiết kế hộp gen M1 của virus cỳm A/H1N1.
RNA tổng số tinh sạch đƣợc sử dụng để tạo cDNA sử dụng bộ kit tổng hợp cDNA của Invitrogen (Mỹ). Cỏc bƣớc tiến hành đƣợc mụ tả ở mục 2.2.3. Nguồn cDNA thu đƣợc sau đú đƣợc sử dụng làm khuụn để khuếch đại gen mó húa protein M1 bằng phƣơng phỏp PCR với cặp mồi đặc hiệu M1pBac-F và M1pBac-R.
Để gen M1 cú thể biểu hiện tốt trong tế bào cụn trựng chỳng tụi đƣa thờm trỡnh tự Kozak, trỡnh tự đúng vai trũ quan trọng trong việc khởi đầu quỏ trỡnh dịch mó ở sinh vật nhõn chuẩn (Kozak, 1987) vào đầu 5’ của gen ngay trƣớc mó mở đầu ATG của mồi xuụi. Sản phẩm PCR (hộp gen M1) đƣợc kiểm tra trờn gel agarose 1% (hỡnh 3.1). Kết quả cho thấy cú một băng DNA duy nhất với kớch thƣớc khoảng 780 bp tƣơng đƣơng với kớch thƣớc gen M1 cú gắn thờm cỏc trỡnh tự thiết yếu theo tớnh toỏn lý thuyết. Nhƣ vậy cú thể sơ bộ kết luận hộp gen M1 của virus cỳm A/H1N1 đó đƣợc khuếch đại đặc hiệu.
Hỡnh 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhõn gen M1 trờn gel agarose 1%.
1: thang DNA 1kb chuẩn (fermentas, Đức) 2: sản phẩm PCR
3.3. Tỏch dũng hộp gen M1 vào vector pCR2.1
Trƣớc khi đƣa vào vector biểu hiện baculovirus, sản phẩm PCR của gen M1
đƣợc tinh sạch qua kit tinh sạch PCR (Fermentas, Đức), sau đú đƣợc đƣa vào vector tỏch dũng pCR2.1 (Invitrogen, Mỹ). Việc tỏch dũng đƣợc thực hiện bằng cỏch gắn trực
1 2 2
tiếp sản phẩm PCR vào vector tỏch dũng pCR2.1 sau đú biến nạp vào E.coli rồi tỏch chiết lại plasmid để chọn lọc vector tỏi tổ hợp. Cỏc vector chứa gen M1 đƣợc kớ hiệu là pCRM1.
3.3.1. Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2.1
Phản ứng gắn đƣợc thực hiện với mục đớch tạo vector tỏi tổ hợp mang đoạn gen cần tỏch dũng. Quỏ trỡnh gắn dựa vào đặc tớnh xỳc tỏc hỡnh thành liờn kết nối hai đoạn DNA của enzym T4 DNA ligase. Chỳng tụi sử dụng enzym T4 DNA ligase cú nguồn gốc từ phage T4 xõm nhiễm E.coli, enzym này cú khả năng nối hai trỡnh tự DNA cả đầu so le và đầu bằng. Mẫu đƣợc ủ ở 14°C trong 16 giờ. Đõy là nhiệt độ thớch hợp nhất cho enzym T4 DNA ligase hoạt động. Vector tỏi tổ hợp mong muốn sẽ là vector gắn với sản phẩm PCR mang gen mó húa protein M1.
3.3.2. Biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α
Plasmid tỏi tổ hợp thu đƣợc từ phản ứng gắn trờn đƣợc biến nạp vào tế bào
E.coli chủng DH5α bằng phƣơng phỏp sốc nhiệt. Nhờ bộ mỏy tổng hợp của vi khuẩn,
plasmid sẽ đƣợc tạo ra cỏc bản sao với số lƣợng lớn. Sau khi biến nạp, thể biến nạp đƣợc cấy trải trờn mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung Amp (100àg/ml), IPTG (1mM) và X- gal (100 àg/ml) (5- brome – 4 chloro -3 indonyl ò galactoside). Sau đú nuụi trong tủ ấm 370C qua đờm. Kết quả thu đƣợc hai loại khuẩn lạc cú màu xanh, trắng (hỡnh 3.2). Cỏc khuẩn lạc màu xanh đƣợc dự đoỏn là cỏc khuẩn lạc mang vector pCR2.1 khụng chứa hộp gen M1, vector tự đúng vũng. Điều này là do gen Lac-Z hoạt động bỡnh thƣờng, tổng hợp đƣợc enzym ò- galactosidase, enzym này sẽ thủy phõn cơ chất X- gal thành sản phẩm cú khả năng kết hợp với oxi tạo chất cú màu xanh da trời là 5,5 dibrome -4,4 dichloro indigo. Ngƣợc lại những khuẩn lạc màu trắng đƣợc dự đoỏn chứa vector tỏi tổ hợp mang hộp gen mó húa protein M1. Việc gen M1 chốn vào giữa Lac – promotor và gen cấu trỳc Lac –Z dẫn đến gen Lac – Z bị dịch chuyển khung đọc mở (ORF) do đú khụng tổng hợp đƣợc enzym ò- galactosidase.
Hỡnh 3.2: Kết quả biến nạp DNA plasmid vào DH5α
3.3.3. Tỏch chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli
Để chọn đƣợc dũng plasmid tỏi tổ hợp pCRM1 mang hộp gen M1, chỳng tụi nhặt một số khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh, nuụi cấy trong mụi trƣờng LB cú