Chương II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 2 giống vừng: vừng vàng và vừng đen Sơn La, được trồng phổ biến ở khu vực Xuân Hòa - Phúc Yên - Vĩnh Phúc.

Các giống vừng này được cung cấp từ Trung tâm tài Nguyên Thực Vật, Viện KHKTNN Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

TN1: Tiến hành thí nghiệm tại trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ - Trường ĐHSP Hà Nội 2

Tiến hành thí nghiệm gieo hạt trong dung dịch theo phương pháp Volcova [67]: Chọn hạt giống to, khỏe, đều, có phôi sáng, không sâu mọt, không nấm mốc. Khử trùng khay đựng, bình… bằng cồn; giấy lọc phải sấy ở 130⁰C trong vòng 1 giờ; hạt được khử trùng bằng dung dịch KMnO₄ 1% trong 5 phút. Hạt vừng này mầm trong dung dịch đường saccarozo với áp suất thẩm thấu là 9 atm. Hạt sinh trưởng trong dung dịch dễ bị nhiễm nấm nên cần cho thêm kháng sinh nistain 1 viên trong 1 lít.

Sau đó chia hạt thành 2 phần gieo trên khay có giấy thấm: Phần 1 được tới bằng nước cất (lô đối chứng), phần 2 được tưới bằng dung dich đường (lô thí nghiệm). Hàng ngày bổ sung lượng nước hoặc dung dịch đường 50ml/ khay.

Tiến hành :

- Xác định khả năng nảy mầm

- Xác định chiều dài mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô của mầm. - Xác định hàm lượng prolin trong mầm vừng.

TN2: Thực hiện tại khu thí nghiệm nhà lưới khoa Sinh – KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2

Gieo hạt vừng vào các chậu. Mỗi chậu trồng 9 cây nhắc lại 3 lần. Tiến hành chăm sóc cho đến khi cây ra hoa.

Chia số chậu thành 2 phần:

- Phần 1: chia làm 2 lô. Lô thí nghiệm tiến hành gây hạn nhân tạo. Lô đối chứng tưới nước bình thường. Tiến hành xác định hàm lượng proline trong rễ, và huỳnh quang diệp lục ở lá, diện tích lá, chiều cao cây

- Phần 2 tiếp tục chăm sóc bình thường cho đến khi ra quả non tiến hành gây hạn để xác định hàm lượng proline trong rễ, và huỳnh quang diệp lục ở lá, diện tích lá giữa lô đối chứng và lô thí nghiệm.

2.2.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu nghiên cứu * Xác định khả năng nảy mầm của hạt

Những hạt nảy mầm là hạt có chiểu dài rễ mầm đạt từ 3 mm trở lên, khả năng nảy mầm được tính theo công thức:

P = ^a 100

b^

Trong đó:

P: Khả năng nảy mầm của hạt

a: Số hạt nảy mầm trong lô thí nghiệm b: Số hạt nảy mầm trong lô đối chứng * Sinh trưởng của mầm vừng.

- Chiều dài mầm (mm)

Dùng thước chia đến milimet để đo. Thời gian đo ngày thứ 3, thứ 5, thứ 7 sau khi gieo.

Cân khối lượng tươi của mầm ngay sau khi thí nghiệm xong (ngày thứ 8) bằng cân điện Sartorius.

- Khối lượng khô của mầm(mg/mầm).

Rửa mầm bằng nước cất, sau đó sấy trong 3h ở nhiệt độ 105⁰C đến khối lượng không đổi. Xác định khối lượng khô sau khi thí nghiệm xong (ngày thứ 8) bằng cân điện Sartorius.

*Xác định chỉ tiêu sinh trưởng của cây:

- Chiều cao cây: Được xác định bằng thước chính xác đến milimet, đo từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng của thân.

- Diện tích lá: Đo diện tích lá trên máy AM 200 – 001 do hãng ADL – Anh sản xuất năm 2003. Lá được lấy là lá thứ 3 từ đỉnh sinh trưởng (lá chét thứ 3 ở tận cùng cuống chính), đây là lá trưởng thành của cây thực hiện đầy đủ chức năng quang hợp, sinh tổng hợp và chuyển hóa các chất cho cây. * Phương pháp xác định hàm lượng proline

- Phương pháp xác định hàm lượng proline theo Bates [38] và cải tiến của Đinh Thị Phòng (2001) [24].

Cân 0.5gam/ mẫu nghiễn kỹ, thêm 10ml dung dich axit sulfosalicylic 3%, ly tâm 7000 vòng/ phút trong thời gian 20 phút, lọc lấy dịch lọc. Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml axit axetic và 2ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nước nóng 100⁰C trong thời gian 1giờ, sau đó ủ trong nước đá 5 phút. Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch màu hồng ở trên đem đo mật độ quang học ở bước sóng 520nm trên máy UV- Visible Spectrophotometer, UV – 2450 do hãng SHIMADZU – Mỹ sản xuất. Hàm lượng prolin được tính theo công thức suy ra từ việc lập đường chuẩn prolin.

Dựng đồ thị chuẩn prolin: Pha prolin chuẩn ở các nồng độ g /ml: 0,01; 0,03; 0,07; 0,1;0,2 và 0,3. Hàm lượng prolin được tính theo công thức:

Y = 1,4083 . X + 0,014 Trong đó: Trong đó:

Y: Hàm lượng prolin(g /ml)

X: Giá trị mật độ quang học đo được ở bước sóng 520nm

* Phương pháp xác đinh hàm lượng huỳnh quang diệp lục lá: bằng máy đo huỳnh quang diệp lục Chlorophyll Fluorometer OS 30 - ADC (Anh). Các tham số đo được gồm: F₀ (huỳnh quang ổn định), F_m (huỳnh quang cực đai), F_vm (huỳnh quang biến đổi). F_vm phản ánh hiệu quả sử dụng năng lượng ánh sáng trong phản ứng quang hóa, được xác định bằng công thức:

Fvm = (Fm - Fo)/ Fm

* Phương pháp xác định hoạt độ một số enzim

- Xác định hoạt độ proteaza theo Phạm Thị Chân Châu [1], [2]

Cách tiến hành: Lấy hai bình nón (V= 100ml), cho vào mỗi bình 2g cơ chất đã nghiền nát và 10ml KH₂PO₄ 0,1N, lắc nhẹ để tạo môi trường pH thích hợp với hoạt động của proteara có trong cơ chất. Thêm vào bình 1 (đối chứng) 10ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzym. Cho vào mỗi bình 2ml dung dịch protein 5% (lòng trắng trứng). Đặt 2 bình trong tủ ấm 37⁰C, thời gian 1 giờ. Sau đó thêm vào bình 2: 10ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzym kết thúc quá trình thủy phân protein. Dùng ống đong đo dung dịch mẫu (V). Lọc dung dịch trong từng bình, đo lại dung tích dịch lọc, chuyển sang bình tương ứng với thí nghiệm (2) và kiểm tra (1). Thêm vào mỗi bình chứa dịch lọc 10ml foocmaldehit và 5 giọt timolphtalein để làm chất chỉ thị màu. Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N đến khi xuất hiện màu xanh mực cửu long.

Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu được tính theo công thức:

X = 2 1 3 ( ).2, 28. . . V V V f V g 

Trong đó:

X: Hàm lượng nitơ amim trong mẫu nghiên cứu V: Số ml dung dịch mẫu

V₁: Số ml NaOH 0,2N chuẩn độ bình đối chứng V₂: Số ml NaOH 0,2N chuẩn độ bình thí nghiệm g: Số gam phân tích mẫu

f: Hệ số điều chỉnh NaOH 0,2N

2,28: Số mg nitơ amin tương ứng với 1ml NaOH 0,2N - Xác định hoạt độ enzym lipaza theo Nguyễn Văn Mùi [22] Cách tiến hành:

+ Cân 5g hạt đã nảy mầm nghiền nhỏ thành dạng đồng thể, chuyển vào bình nón 100ml, cho thêm 10ml nước cất, lắc đều.

+ Cho thêm 10ml dầu lạc làm cơ chất và 5ml dung dịch đệm axetat pH=4,7 với vài giọt toluen. Trộn đều hỗn hợp cho vào tủ ấm 30⁰c trong 20 đén 24 giờ.

+ Bình kiểm tra phải đun sôi dịch enzym 3 đến 5 phút để làm mất hoạt động của enzym trước khi cho tiếp xúc với cơ chất.

+ Sau khi ngừng phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96% và 15 đến 25ml ete. Lắc đều, để lắng

+ Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH ) 0,1N với 0,5ml chỉ thị màu phenolphtalein.

Hoạt độ lipaza được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N trong 10g hạt theo công thức: X = ^{( ). .10}

w

a b f

Trong đó:

X: Hoạt độ enzim lipaza

b: Số ml NaOH 0,1N chuẩn độ bình đối chứng f: Hệ số điều chỉnh NaOH 0,1N

w: Khối lượng hạt

- Xác định hoạt độ enzym amylaza theo Phạm Thị Ánh Hồng [7]

Cân 10g hạt nảy mầm cho vào cối với 30ml nước cất, giã nát dưới nước, lọc. Lấy dịch lọc,cho vào dịch lọc 4 lần thể tích cồn tuyệt đối, khuấy đều. Để lắng, đổ phần nước bên trên qua 1 tấm giấy lọc, không đổ phần cặn vào giấy lọc mà rửa cặn 3 - 4 lần bằng cồn tuyệt đối, tất cả nước rửa đều lọc trên cùng 1 tờ giấy lọc. Sau lần rửa cuối, đổ nốt phần cặn lên tờ giấy lọc. Khi tất cả cồn chảy hết, để 1 ống nghiệm sạch dưới phễu và đổ trên giấy lọc 20ml nước để hòa tan chất trầm hiện có trong cặn. Ta có dung dịch amylase khá tinh sạch.

Cho vào 1 erlen: 100ml hồ tinh bột 3% và 5ml nước chiết amylase, đặt trong bồn ổn nhiệt ở 40độC. Sau 30 phút lấy 25ml hỗn hợp tinh bột và dịch chiết cho vào 1 erlen khác, thêm 10ml dung dịch NaOH 0,5N để làm bất hoạt amylase, thêm nước cho đủ 50ml. Lấy 5ml hỗn hợp vừa pha loãng để định lượng đường maltose theo phương pháp Wilistatetter schudel.

Định lượng đường maltose: lấy 2 erlen 250ml.

+ Bình 1 (thử thật): Cho 5ml hỗn hợp cần xác định hàm lượng maltose, 10ml dung dịch iod N/10, 15ml dung dịch NaOH N/10. Thời gian nhỏ NaOH phải kéo dài gần 2 phút (nhỏ từng giọt). Để yên trong tối 15 - 20 phút. Sau đó lấy ra cho thêm vào 2ml H₂SO₄ 2N. Định phân lượng thừa bằng dung dịch

Na₂S₂O₃ N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng và định phân để làm chất chỉ thị màu).

+ Bình 2 (bình thử không): Thay 5ml hỗn hợp cần xác định maltose bằng 5ml nước cất, các bước tiếp theo thực hiện tương tự bình 1.

Hoạt độ enzym amylaza được tính theo công thức: X = 0 3 ( ).342 20.10 .2.w.t V V K  

Trong đó: V₀: Số ml Na₂S₂O₃ 0,05N dùng để chuẩn độ bình đối chứng V: Số ml Na₂S₂O₃ 0,05N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm

K: Hệ số điều chỉnh nồng độ Na₂S₂O₃ 0,05N 342: Trọng lượng phân tử đường maltoza w: Khối lượng nguyên liệu

t: Thời gian phản ứng

2.2.3 Phương pháp xử lý thống kê các kết quả thực nghiệm [21] Kết quả thí nghiệm được xử lý theo các tham số:

n X X n i





Trong đó:

G

md : Sai số của hiệu các trung bình số học

Tiêu chuẩn độ tin của hiệu được so với bảng tiêu chuẩn Student với số bậc tự do: n₁+ n₂ -2.

Trong đó: n₁: Số lần nhắc lại công thức thí nghiệm n₂ : Số lần nhắc lại công thức đối chứng

Sự sai khác giữa các trị số trung bình chỉ có ý nghĩa khi t_d lớn hơn hoặc