Nhận xét : Quan sát hai biểu đồ, ta đều thấy tấn suất xuất hiện đột biến dương lớn nhất là trong khoảng 115 - 125% trên cả hai chủng vsv kiểm định Gr (+) và (-). Các đột biến âm tính có tần suất 85-90% xuất hiện không nhiều trong lần thử nghiệm đột biến này.
Như vậy, sau khi đột biến kết hợp với sàng lọc ta đã chọn được 6 biến chủng có hoạt lực kháng sinh cao hơn so vód chủng khởi điểm khoảng trên 20%. Đó là các biến chủng 32.1, 32.3, 32.7, 32.18, 32.20, 32.29.
2.3.5.Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh :
Từ các biến chủng được chọn lọc qua sàng lọc và đột biến, tiến hành lên men quy mô thí nghiệm trên máy lắc.
Kết quả lên men sau khi sàng lọc được giới thiệu ở bảng 5. Bảng 5: Kết quả lên men sau sàng lọc.
Biến chủng Kết quả Môi Bp Pseu D (mm) s D (mm) s 32 Gauzel 13,56 0,63 17,84 0,47 MT2 12,36 0,21 16,55 0,35 MT4 13,42 0,57 17,21 0,96
Nhận x é t: Ta thấy trong môi trường Gauzel và MT4, Streptomyces 315 đều đã cho kết quả lên men rất tốt. Hoạt lực kháng sinh ở môi trường Gauzel và MT4 cao hơn MT2 khoảng 10%. Như vậy, biến chủng 32 của Streptomyces 315 không chỉ cho hoạt lực kháng sinh cao khi nuôi cấy bề mặt mà còn cho kết quả khá tốt khi lên men chìm ở hai môi trường Gauzel và MT4.
2.3.6. Kết quả chiết xuất và tinh chế:
• Kết quả về ảnh hưởng của pH lên độ ổn định của hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men :
Dịch lọc của dịch lên men được đem chỉnh về các pH khác nhau trong dải pH từ 3 - 11. Sau 1 ngày để ở nhiệt độ thường, đem thử hoạt tính của dịch lên men đã chỉnh về pH
trung tính. Kết quả về độ ổn định của hoạt tính kháng sinh trong các pH khác nhau của dịch lên men được thể hiện ở bảng 6 dưới đây .
Bảng 6; Kết quả về ảnh hưởng của pH đến độ ổn định của hoạt tính KS.
Độ pH D (mm) s % biến đổi hoạt tính
3 13,08 0,75 86,2 4 13,45 0,46 88,6 5 14,06 0,86 92,6 6 13,22 0,76 87,1 7 14,10 1,34 92,9 ị ẳ . , ... i 15,18 0,27 100 8 14,19 0,76 93,5 9 12,51 1,15 82,4 10 13,51 1,35 88,9 11 14,04 0,34 92,5
Nhận x é t: Qua bảng trên ta thấy dịch lên men có khả năng chịu bền tốt đối với các pH khác nhau. Tuy nhiên, với pH gốc của dịch lên men là 7,5 thì hoạt tính kháng sinh vẫn thể hiện mạnh nhất.
• Kết quả chiết xuất kháng sinh:
Tiến hành chiết kháng sinh một lần bằng các dung môi khác nhau trên các pH khác nhau vói tỷ lệ Voungmôi: VDịchiọc = 1:3 . Kết quả xin giới thiệu ở bảng 7.
Bảng 7; Kết quả chiết xuất KS bằng các dung môi khác nhau.
\ pH 4 7,5 9
D.moK DD.m Sd.hi Do.m ^D.m Dd.iii So.m Dh,o ^H._0
CHCI3 12,46 0 , 2 1 10,33 0,19 15,21 |-:o,35 - 12,37 0,82 11,77 0,54 10,49 0,36
BuOAc 10,97 0 , 1 1 1 0 , 2 2 0,45 14,21 0,45 12,19 0,56 9,57 0,72 9,43 0,74
Nhận xét. Sau khi thử chiết suất bằng 3 loại dung môi trên, ta thấy kháng sinh được chiết xuất tốt nhất bằng dung môi cloroíorm ở pH 7,5.
Tiến hành chiết 1 lần bằng cloroíorm ở các tỷ lệ khác nhau, kết quả giới thiệu ở bảng 8.
Tiến hành chiết nhiều lần kháng sinh bằng cloroíorm ở pH 7,5 với tỷ lệ 1:5 , kết quả giới thiệu ở bảng 9.
Bảng 9: Kết quả chiết nhiều lần. Pha T ỷ lẹ X V* CHCIị • * D . lọc ^ chciị Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 3 1:5 17,74 12,72 10,81 0
Nhận x é t: Qua các bảng trên ta thấy :
- Khi chiết 1 lần bằng dung môi thích hợp, trong pha nước vần còn một phần kháng sinh chưa chiết hết ở các tỷ lệ V d m : V d.iọ c = 1:3,1:4 và 1:5.
- Khi chiết nhiều lần (trong trườnghợp này là 3 lần), kháng sinh ỏ pha nước đã được chiết hoàn toàn sang pha cloroíorm với tỷ lệ 1:5.
Do vậy phương pháp chiết nhiều lần bằng dung môi cloroíorm ở pH 7,5 với tỷ lệ Vdm : V d.iọ c =1:5 cần được sử dụng để nghiên cứu sâu thêm.
Chú thích :
- CHCI3 : pha cloroform.
- BuOH : pha n-butanol.
- H2O : pha nước sau khi đã lắc và gạn đi dung môi hữu cơ. • Kết quả sắc ký lớp m ỏng:
Sau khi chiết kháng sinh từ dịch lên men sang dung môi hữu cơ ta thu được một hỗn hợp kháng sinh khá sạch. Tiến hành sắc ký trên bản mỏng để xác định thành phần kháng sinh và lấy đó làm cơ sở cho việc tinh chế sau này. Kết quả sắc ký được giới thiệu ở bảng 10 và hình 6.
Bảng 10: ]<^ết quả sắc ký lớp mỏng. Kết quả
Hê dung
Rf
ư v v s v Hiện màu thuốc thử Hệ 1 Cloroform;Ethylacetat:acid formic (2:10:2) 0,32-0,64-0,74 0,64 0,64 Hệ 2 Butanol:Ethylacetat:Etanol (2:5:4) Không hiện rõ vết tử ngoại 0,74 0,74 Hệ 3
Cloroform bão hoà Amoniac IN (2:1)
Không hiện rõ
vết tử ngoại 0,10 0,10
2.5.7. Hinh thái xạ khuẩn Streptomyces 315 và sơ bộ phân loại:
Đã quan sát hình thái xạ khuẩn Streptomyces 315 dưới kính hiển vi điện tử vói độ phóng đại 10.000 và 20.000 lần. Kết quả giới thiệu ở hình 7 và 8 (phần phụ lục).
Hình 7: Đặc điểm hình thái bào tử của xạ khuẩn Streptomyces 315.
Hình 8: Đặc điểm hình thái chuỗi bào tử của xạ khuẩn Streptomyces 315.
Bào tử Streptomyces 315 có hình tương tự đốt ngón tay, kích thước khoảng từ 600-800nm.
❖ Màu sắc của khuẩn ty khí sình: Đây là màu sắc của khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành. Màu sắc phát hiện được là màu xám (hơi trắng). Căn cứ vào việc xác định của chuẩn ISP ta đánh giá khuẩn ty khí sinh có ký hiệu là (G).
<♦ Xác định sắc tố melanoỉd: sắc tố melanoid xuất hiện rất rõ rệt trong quá trình nuôi cấy trên môi trường ISP đặc hiệu nên ký hiệu là (1).
❖ Màu sắc của khuẩn ty cơ chất: Không có màu sắc gì đặc biệt trong quá trình nuôi cấy trên môi trường phân loại ISP nên ký hiệu là (0).
❖ Sắc tô hoà tan: không sản xuất sắc tố hoà tan. Ký hiệu là (0).
<♦ Đặc điểm hình thái chuỗi bào tử: qua kính hiển vi với độ phóng đại 10.000 lần đã xác định được chuỗi bào tử có dạng thẳng hơi cong (Rectiflexibiles) ký hiệu là RF. <♦ Bê mặt hình dáng bào tử: qua kính hiển vi với độ phóng đại 20.000 lần xác định
được bề mặt bào tử là dạng trơn nhẩn không có gai, ký hiệu là sm.
❖ Khả năng sử dụng nguồn cacbon: với mỗi nguồn cacbon, việc sử dụng hay không được đánh giá bằng sự phát triển xạ khuẩn trên môi trường nuôi cấy so với mẫu chứng. Nếu chúng phát triển thì là (+), không phát triển là (-), không xác định rõ (±).
Qua các thông số xác định ở trên, ta lập được bảng đánh giá phân loại Streptomyces
Bảng 11: Kết quả phân loại Streptomyces 315 và một số đặc điểm phân loại của Streptomyces diastochromogenes. s *5 a Ể s: Cd u 3 o c Ể pC D e I Ã '‘Ọ c>5 g "pO ŨS D u o /c5 pO Í5* s n o c 2 c« Ìn o õ I i 9 Ạ ÌLị;iN s ?3 CỔ (ỉ; Ẽ c« uu Ỉ5 ử5 o; s ễCQ Streptomyces 315 0 0 RF sm + Streptomyces diastatochromogenes G 1 0 0 SRF sm + +
Nhìn vào bảng kết quả trên, ta thấy các đặc điểm của Streptomyces 315 gần như hoàn toàn trùng khớp với đặc điểm của Streptomyces diastochromogenes, duy chỉ có hình dáng chuỗi bào tử là hoi khác biệt nên vẫn còn phải nghiên cứu tiếp để có kết luận chính xác. Tuy nhiên đến đây ta có thể sơ bộ phân loại chủng Streptomyces 315 là chủng Streptomyces diastatochromogenes bởi ngoài những kết quả trong bảng trên thì
Streptomyces 315 còn có những đặc điểm trùng với Streptomyces diastatochromogenes
như sau:
- Streptomyces diastatochromogenes có chuỗi bào tử thường cuộn xoắn lại, tuy nhiên dạng ngoằn nghoèo và dạng thẳng cũng thấy xuất hiện. Chuỗi bào tử khi trưởng thành thường gồm hơn 50 bào tử gắn trên một chuỗi. Hình thái này được xác định trên môi trường nuôi cấy bao gồm môi trường malt, môi trường yến mạch, môt trường muối-
tinh bột, nhưng khuẩn ty khí sinh có thể sẽ phát triển kém hoặc mất hẳn trên môi trường chứa glycerin - asparagine. Bề mặt của bào tử là dạng trofn nhấn.
- Màu sắc của khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty khí sinh có màu xám khi được nuôi cấy trên môi trường malt, môi trường yến mạch, môt trường muối - tinh bột. Khuẩn ty khí
sinh có thể sẽ mất hẳn trên môi trưòíng glycerin - asparagine hoặc có thể xuất hiện
khuẩn ty khí sinh màu trắng trên môi trường yến mạch và môi trường muối - tinh bột. - Màu sắc của khuẩn ty cơ chất: nhìn chung không có sắc tố gì đặc biệt (có thể xuất hiện màu nâu nhạt trên môi trường malt, màu vàng nhạt hoặc vàng xám trên môi trường yến mạch, môi trường muối - tinh bột và môi trưòỉng glycerin - asparagine ).
- Màu sắc của môi trường nuôi cấy: sắc tố melanoid tạo thành trên môi trường chứa peptone - cao nấm men - sắt, môi trường chứa tyrosine, môi trưèmg chứa tryptone - cao nấm men và môi trường Gauze 2.
- Khả năng sử dụng nguồn cacbon: Streptomyces dỉastatochromogenes phát triển tốt trên tất cả các môi trường chứa D-glucose, L-arabinose, D-xylose, i-insitol, D- manitol, D-fructose, rhamnose, saccarose và raffinose.
Như vậy, qua các nghiên cứu trên, ta có thổ đánh giá sơ bộ về sự trùng khớp của chủng Streptomyces 315 với Streptomyces diastatochromogenes. Để có được những kết luận chính xác hơn thì vẫn cần phải tiếp tục phân tích sâu thêm, thậm chí phải xác định chúng thông qua các ngân hàng dữ liệu chủng vi sinh vật của thế giói. Tuy nhiên đây vẫn là một đánh giá có ích cho việc phân loại cũng như đi sâu nghiên cứu hơn nữa về chủng Streptomyces 315 này.
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT. 3.1. Kết luận:
Qua thời gian làm thực nghiệm một cách tích cực và nghiêm túc, chúng tôi đã hoàn thành tốt các mục tiêu đặt ra và thu được những kết quả sau:
- Đã tiến hành đột biến cải tạo giống kết hợp sàng lọc qua 1 thế hệ và chọn được 6
biến chủng có hoạt lực kháng sinh tăng cao so với chủng khỏi điểm: Biến chủng 32.1 tăng 123,4 % trên VK Gr(+) và 129,9 % trên Gr(-). Biến chủng 32.3 tăng 121,3 % trên VK Gr(+) và 130,0 % trên Gr(-). Biến chủng 32.7 tăng 121,7 % trên VK Gr(+) và 128,2 % trên Gr(-). Biến chủng 32.18 tăng 123,9 % trên VK Gr(+) và 125,2 % trên Gr(-). Biến chủng 32.20 tăng 121,8 % trên VK Gr(+) và 125,7 % trên Gr(-). Biến chủng 32.29 tăng 119,9 % trên VK Gr(+) và 127,9 % trên Gr(-). - Đã tiến hành lên men trên máy lắc cho kết quả tốt.
- Khảo sát việc chiết nhiều lần kháng sinh từ pha nước sang cloroíorm ở pH 7,5 với tỷ lệ dung môi và dịch lọc là 1:5; kháng sinh được chiết hoàn toàn.
- Đã tiến hành sắc ký bản mỏng trên một số hệ dung môi. Kết quả ban đầu cho thấy trong dịch chiết có ít nhất một thành phần có hoạt tính kháng sinh.
- Sơ bộ phân loại chủng Streptomyces 315 có tuyệt đại đa số đặc điểm trùng khớp
với Streptomyces diastatochromogenes.
3.2. Đề xuất:
Kết quả nghiên cứu bước đầu đã thu được những kết quả khả quan về chủng
Streptomyces 315. Chúng tôi rất mong muốn đề tài sẽ tiếp tục được nghiên cứu theo một số hưóỉng mà chúng tôi chưa có thời gian tiến hành đầy đủ:
Xác định thời gian chiếu ánh sáng ư v thích hợp ở khoảng cách 40cm nhằm lấy các đột biến dương.
Tinh chế tiếp để có thể chiết tách được kháng sinh đơn chất, từ đó xác định cấu trúc cũng như các đặc tính hoá lý và sinh học của kháng sinh này.
Tối ưu hoá và ổn định quy trình lên men trên máy lắc, nâng cao hiệu suất lên men, đặc biệt là lên men sau đột biến.
Tiếp tục đi sâu nghiên cứu phân loại để khẳng định sự trùng khớp của