ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.4. Tạo dòng gen
2.2.4.1. Nhân đoạn gen 12S rRNA
Chúng tôi tiến hành phân lập gene 12S rRNA dựa trên kỹ thuật PCR,
các cặp primer sử dụng để phân lập được thiết kế dựa vào trình tự được đăng ký trên Genebank với mã số ….bằng phần mềm Primer 3.
Bảng 2.1: Cặp primer sử dụng trong phân lập gen 12S rRNA
Gene Primer Trình tự Tham
khảo 12S rRNA dNTP (12S R) 5’- GGTGTGTGCGCGCTCCAGAG-3’ dNTP (12S F) 5’- CTTAGCCCTTAACACAGACA-3’ Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 200 ng ADN, 12,5 µL 2× PCR master mix (2,4 mM dNTP mỗi loại, 0,3 đơn vị Taq ADN polymerase
(Fermentas, Canada), 10 pmol primer xuôi, 10 pmol primer ngược và bổ sung nước vô trùng để đạt thể tích phản ứng là 25 µL.
Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt (iCycler, Bio – Rad) theo chu trình sau: biến tính geneome 95oC/4 phút; tiếp đến là 30 chu kỳ: 94oC/45 giây, 52oC/ 1 phút, và 72oC/1 phút; cuối cùng là 72oC/10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 1% với thuốc nhuộm ethydium bromide (EtBr) (0,5 µg/L) và phân tích hình ảnh điện di bằng hệ thống đọc UV trực tiếp.
2.2.4.2. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, một số lượng lớn các phân tử ADN của vùng cần nghiên cứu đã được nhân lên. Sản phẩm tinh sạch có thể được dùng để giải trình trình tự trực tiếp hoặc dòng hóa vào plasmid
vector với hiệu suất tiếp nhận cao hơn. Chúng tôi tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng bộ hóa chất của hãng Promega (Wizard®SV Gel and PCR CleanUp System), tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau: Thêm dung dịch Membrane Binding Solution (MBS) vào sản phẩm PCR theo tỷ lệ 1:1 (ví dụ: 100 µL dung dịch MBS vào ống chứa 100 µL sản phẩm PCR cần tinh sạch) trộn đều. Chuyển toàn bộ dung dịch lên trên màng của cột lọc, ủ trong 1 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch phía dưới cột lọc. Rửa cột với 700 µL dung dịch Membrane Wash Solution (WB), ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch dưới. Tiếp tục, rửa cột với 500 µL WB, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Cuối cùng, chuyển cột sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µL Nuclease – Free Water vào chính giữa màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, thu sản phẩm PCR đã được tinh sạch. Ký hiệu và bảo quản ở –20ºC cho đến khi sử dụng.
2.2.4.3. Tạo dòng và phân tích trình tự các gene
Sản phẩm PCR được tạo dòng trong vector pGEM® – T easy (Promega), thành phần phản ứng gắn bao gồm: 1 µl vector pGEM® – T easy, 5 µL đệm, 1µl T4 ADN ligase, 1µl sản phẩm, sau đó bổ sung nước vô trùng để đạt thể tích cuối cùng 10 µL, phản ứng được ủ ở 4ºC qua đêm. Dung dịch gắn được biến nạp vào tế bào E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt, thể biến nạp được chọn lọc bằng phương pháp khuẩn lạc xanh – trắng, tách chiết plasmid và kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với cặp primer 12S rRNA.
2.2.4.4. Biến nạp bằng sốc nhiệt
Tạo tế bào khả biến E. coli DH5α theo phương pháp CaCl2 có cải tiến. Với mục đích tạo ra được dòng vi khuẩn có màng tế bào cho phép gen ngoại lai dễ dàng đi vào khi xử lý bằng sốc nhiệt hoặc xung điện.
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Cấy 1 khuẩn lạc đơn vào 5ml môi trường LB và ủ qua đêm ở nhiệt độ 370C, lắc 200 vòng/phút.
- Chuyển 1ml tế bào đã nuôi qua đêm vào 100ml môi trường LB trong chai 500ml.
- Nuôi tế bào cho đến khi OD600= 0,5 (200 vòng/phút, 1,5-3 giờ) ở 370C - Thu tủa tế bào bằng cách chuyển môi trường nuôi vào ống 50ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong vòng 5 phút (40C).
- Loại bỏ môi trường. Dựng đứng ống trên giấy trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn môi trường.
- Hòa tan mỗi ống với 12.5ml 0.1M CaCl2 đặt trong đá 15 phút - Ly tâm 4000 vòng/phút, 40C.
- Loại bỏ môi trường.
- Hòa tan mỗi ống với 2ml 0,1M CaCl2 và 300µl glycerol đã khử trùng và đặt trong đá 2 giờ.
- Phân phối 200µl tế bào vào ống eppendoff , làm lạnh bằng nito lỏng và bảo quản ở -700C.
Biến nạp bằng sốc nhiệt
Nguyên tắc
Dưới tác động sự thay đổi đột ngột của nhiệt độ làm cho sự giãn nở các lỗ màng tế bào của tế bào khả biến, từ đó DNA ngoại lai dễ dàng xâm nhập vào bên trong màng tế bào.
Các bước tiến hành
Biến nạp vector vào tế bào khả biến:
- Chuẩn bị: ủ vector đã gắn DNA ở nhiệt độ 250C trong 1 giờ, tăng nhiệt độ làm tăng chuyển động Brown giúp cho các phân tử DNA dễ dịch chuyển vào trong vector.
- Làm tan tế bào khả biến: tế bào khả biến được ủ trong đá từ 1,5 đến 2 giờ để tan từ từ tránh sốc nhiệt.
- Bổ sung 10 µl sản phẩm gắn vào 200µl tế bào khả biến, dung pipet đảo nhẹ, ủ đá 3 tiếng.
- Tiến hành sốc nhiệt: 420C /45 giây, làm lạnh nhanh trong đá 10 phút - Bổ sung 500 µl môi trường LB, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong vòng 1,5 giờ
- Cấy dịch vi khuẩn E.coli đã biến nạp lên môi trường LB đã bổ sung ampicillin (50µg/ml) với 2 nồng độ 100µl và 200µl, ủ qua đêm ở 37oC để sàng lọc tiếp.
2.2.4.5. Tách chiết và tinh sạch plasmid DNA
Plasmid tái tổ hợp được chúng tôi tách chiết bằng cách sử dụng bộ hóa chất tách chiết plasmid tái tổ hợp của hãng Promega (PureYeid Plasmid Miniprep System). Tách chiết ADN plasmid được thực hiện nhờ các dung dịch có khả năng làm ly giải tế bào vi khuẩn, loại bỏ ADN hệ gene vi khuẩn khỏi ADN plasmid bằng các loại muối vô cơ có trong dung môi của bộ Kit. Sau đó dung dịch chứa ADN plasmid được chuyển sang cột lọc, có cấu tạo màng lọc tích điện dương (+), chỉ giữ lại ADN plasmid tích điện âm (–), qua nhiều lần ly tâm. Các bước tiến hành tách ADN plasmid tái tổ hợp thực hiện theo phương pháp của hãng sinh phẩm Promega như sau: Chuyển dịch nuôi cấy ở trên sang ống Eppendorf 1,5 mL, ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế bào. Sau ly tâm bỏ dịch bên trên, giữ cặn tế bào bên dưới (dùng pipet hút hết dịch trong giữ lại cặn tế bào). Tiếp theo, thêm 600 µL nước cất vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho đều. Thêm 100 µL dung dịch Cell Lysis Buffer vào hỗn dịch trên để phá màng tế bào, đậy nắp, nhẹ nhàng trộn bằng cách lắc xuôi ngược toàn bộ vài lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút. Tiếp tục, thêm 350 µL dung dịch Neutralization Solution (nhiệt độ 4-80C) , trộn nhẹ nhàng, sau đó đem ly tâm ở 16000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 4oC. Sau đó, chuyển toàn bộ phần dịch trong bên trên lên trên màng của
cột lọc. Ly tâm 16000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới. Thêm 200 µL dung dịch Endotoxin Removal Wash lên trên màng lọc, sau đó ly tâm 16000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới. Rửa với 400 µL dung dịch Comlum Wash Solution lên màng lọc, ly tâm 16000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới. Ly tâm lại để làm khô cột. Cuối cùng, chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, them 50 µL dung dịch Elution Bufer lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 16000 vòng/phút trong 15 giây, bỏ cột lọc và thu được dịch chứa ADN plasmid ở dưới. Mẫu được ký hiệu mẫu và bảo quản ở – 20oC.
Sau khi tách chiết plasmid tái tổ hợp bằng kit PureYeid Plasmid Miniprep System (Promega), mẫu plasmid tái tổ hợp tinh sạch được gửi đi Công ty TNHH Phát Triển Công Nghệ Ứng Dụng Việt Nam (VNDAT Co., Ltd Ha Noi office) để phân tích trình tự nucleotide.