4.5.1. Đánh giá kết quả Nested- PCR:
Các mẫu ADN đều đ−ợc kiểm tra chất l−ợng ADN tr−ớc khi thực hiện kỹ thuật. Đánh giá kết quả Nested- PCR với vùng gen X (Bảng 3.10), cho thấy có nhiều sản phẩm PCR trên cùng một mẫu bệnh nhân, đ−ợc đánh giá là có sự phân ly vùng gen X. Tỷ lệ bệnh nhân có ADN(+) phân ly vùng gen X trong huyết thanh gặp ở nhóm HCC cao hơn nhóm chứng và ng−ợc lại, số bệnh nhân nhóm chứng có tỷ lệ ADN(+) không phân ly nhiều hơn. Sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Các sản
23
phẩm phân ly sau khi đ−ợc giải trình tự cho thấy đấy là các gen X bị đột biến đoạn.
Nh− vậy đánh giá hiện t−ợng phân ly vùng gen X trong huyết thanh có thể có ý nghĩa trong tiên l−ợng nguy cơ HCC, gián tiếp đánh giá đột biến gen X ở bệnh nhân mang HBsAg mạn tính.
4.5.2.Đánh giá kết quả giải trình tự gen:
Kỹ thuật BigđDye-termination sequencing đ−ợc thực hiện theo h−ớng dẫn của nhà sản xuất. Thử ngẫu nhiên với 3 mẫu ở hai ngày khác nhau, kết quả cho thấy không thấy có sự sai khác về trình tự Nu giữa hai lần thực hiện kỹ thuật.
Kỹ thuật Cloning thực hiện tr−ớc khi giải trình tự sẽ cho kết quả chính xác hơn và đặc biệt là có thể xác định đ−ợc hai đầu mồi của sản phẩm PCR sử dụng để khuếch đại. Dựa vào trình tự hai mồi đ−ợc phát hiện ở hai đầu, cho phép đánh giá đ−ợc cả đoạn sản phẩm đã đ−ợc khuếch đại, loại bỏ những nghi ngờ về đứt gãy ADN trong quá trình thực hiện kỹ thuật tách ADN, loại bỏ khả năng gắn mồi không đặc hiệu.
Sau khi giải trình tự gen xác định đ−ợc các đột biến đoạn vùng gen X, kết quả cho thấy, sử dụng cặp mồi X1, CR2 thực hiện kỹ thuật Nested-PCR có thể gián tiếp đánh giá tình trạng đột biến vùng gen X của HBV là đột biến cắt đoạn hay thêm đoạn.
Kết luận