Ph ng pháp s c kí trao đ i ion cho k t qu chính xác h n ph ng pháp m c 2.2.3.1 do ph ng pháp s c kí trao đ i ion ch đ nh l ng duy nh t ion oxalat trong môi tr ng nuôi c y. Tuy nhiên ph ng pháp này t ng đ i ph c t p, chi phí cao. Vì v y chúng tôi ch n 4 ch ng m nh nh t nuôi c y trong đi u ki n hi u khí: H18.3, H21.1, H19.2, H20.9 và 2 ch ng m nh nh t nuôi c y trong đi u ki n k khí: K29.4, K22.4 đ đnh l ng chính xác kh n ng phân h y oxalat c a nh ng ch ng m nh nh t. B ng 3.5. K t qu đnh l ng mu i oxalat b ng ph ng pháp s c ký trao đ i ion Mã ch ng L ng mu i oxalat còn l i trung bình (g) L ng mu i oxalat gi m trung bình (%) H18.3 0,000 ± 0,000 a 100,0 ± 0,000 a H21.1 0,000 ± 0,000 a 100,0 ± 0,000 a H19.2 0,000 ± 0,000 a 100,0 ± 0,000 a H20.9 0,000 ± 0,000 a 100,0 ± 0,000 a K29.4 0,466 ± 0,002 b 24,58 ± 0,325 b K22.4 0,464 ± 0,002 b 24,87 ± 0,391 b C 0,618 ± 0,000 c 0,000 ± 0,000 c Trong cùng m t c t, các tr s có cùng m u t không có s khác bi t m c ý ngh a 95% qua phép th Duncan.
KHÓA LU N T T NGHI P K T QU VÀ TH O LU N
Bi u đ 3.2. L ng oxalat gi m (%) sau 24 gi nuôi c y
D a vào k t qu b ng 3.7 và bi u đ 3.2, chúng tôi nh n th y có 4 ch ng: H18.3, H21.1, H19.2, H20.9, gi m oxalat cao nh t (oxalat gi m 100%), th p nh t là 2 ch ng k khí: K29.4, K 22.4 (24.58 ± 0.325%). Hi n nay, ph ng pháp s c kí trao đ i ion đ c s d ng đ đnh l ng mu i oxalat ph bi n b i tính chính xác cao. Theo nghiên c u c a Goldfarb (2008), sau khi s d ng h n h p vi khu n lactic, n c ti u c a b nh nhân đ c thu nh n và xác đnh l ng oxalat b phân h y b ng ph ng pháp s c ký trao đ i ion, k t qu l ng oxalat trong m u gi m 6,26%. Bên c nh đó, theo báo cáo c a Murhy và c ng s (2008), Allison và c ng s (1985) c ng xác đnh l ng oxalat b phân h y b i vi khu n b ng ph ng pháp s c ký trao đ i ion.
3.3. K T QU NH DANH
D a vào k t qu quan sát đ i th (hình d ng, màu s c khu n l c) và k t qu quan sát vi th (hình d ng t bào, cách b t màu khi nhu m Gram), chúng tôi ti n hành m t s th nghi m sinh hóa theo khóa phân lo i Cowan và Steel (Cowan và Steel, 1993). K t qu đnh danh đ c trình bày trong b ng 3.6. và b ng 3.7.
0 20 40 60 80 100 120 ĐH18.3 ĐH21.1 ĐH19.2 ĐH20.9 ĐK29.4 ĐK22.4 ĐC P h n tr m (% ) Mã ch ng L ng mu i oxalate gi m (%)
KHÓA LU N T T NGHI P K T QU VÀ TH O LU N
B ng 3.6. K t qu th nghi m sinh hóa nhóm c u khu n Gram âm
Th nghi m H18.3 H19.2 H21.1 Hi u khí + + + Catalase + + + Oxidase + + + Sinh s c t trên NA - - - Tiêu huy t - - - 22oC w w w NA + + + Glucose - - - Lactose - - - Maltose - - - Sucrose - - - Nitrate + + + K t qu Branhamella catarrhalis Ghi chú: (+) d ng tính (-) âm tính (w) ph n ng y u T b ng 3.8, k t qu thu đ c cho th y ch ng: H18.3, H19.2, H21.1 t ng đ ng v i loài Branhamella catarrhalis. Chúng tôi th c hi n đ c 13 th
KHÓA LU N T T NGHI P K T QU VÀ TH O LU N nghi m trong t ng 15 th nghi m sinh hóa, trong đó có 12/13 th nghi m t ng đ ng v i loài Branhamella catarrhalis (92,30% t ng đ ng).
B ng 3.7. K t qu th nghi m sinh hóa nhóm tr c khu n Gram d ng có bào t Th nghi m H20.9 Th nghi m H20.9 Catalase + Di đ ng + K khí - Urease + 50o - VP - 10% NaCl - Nitrate - Glucose - Casein + Cellobiose - Tinh b t + Galactose - Oxydase - Mannose - Xylose - Melibiose - Citrate + Rafinose - Indol - Salicin - K t lu n Bacillus sphaericus Ghi chú: (+) d ng tính (-) âm tính
T b ng 3.9, k t qu thu đ c cho th y ch ng: H20.9 t ng đ ng v i loài
Bacillus sphaericus. Chúng tôi th c hi n đ c 21 th nghi m trong t ng 27 th nghi m sinh hóa, trong đó có 17/21 th nghi m t ng đ ng v i loài Bacillus
KHÓA LU N T T NGHI P K T QU VÀ TH O LU N Nh v y, chúng tôi phân l p đ c 4 ch ng vi khu n, trong đó 3 ch ng t ng đ ng loài Branhamella catarrhalis và 1 ch ng t ng đ ng loài Bacillus sphaericus t m u đ t tr ng cây có kh n ng phân gi i canxi oxalat. Không tìm th y vi khu n phân gi i canxi oxalat trong m u phân em bé và m u ru t gà. N m 1947, m t báo cáo c a Bhat và Barber đã phân l p đ c vi khu n Vibrio oxaliticus trong m u đ t v n có kh n ng phân h y canxi oxalat; nghiên c u c a Khambata và Bhat (1953), phân l p đ c vi khu n Pseudomonas oxalatic có kh n ng phân h y canxi oxalat
KHÓA LU N T T NGHI P K T LU N VÀ NGH
CH NG 4.
KHÓA LU N T T NGHI P K T LU N VÀ NGH
4.1. K T LU N
Sau th i gian th c hi n nghiên c u, chúng tôi đã thu nh n đ c các k t qu nh sau:
Phân l p đ c 12 ch ng vi khu n có kh n ng phân gi i canxi oxalat t 113 m u t các ngu n phân em bé, ru t gà, đ t v n. Các ch ng này đ u có ngu n g c t m u đ t.
Các ch ng vi khu n H18.3, H19.2, H21.1, H20.9, K29.4 và K22.4 cho k t qu phân h y oxalat b ng ph ng pháp oxi hóa kh m nh nh t.
Kh o sát l ng oxalat b phân h y b ng ph ng pháp s c kí trao đ i ion c a 6 ch ng có ho t tính m nh nh t, k t qu thu đ c 4 ch ng hi u khí H18.3, H19.2, H21.1, H20.9 có kh n ng phân h y 100% l ng oxalat trong môi tr ng nuôi c y sau 24 gi .
nh danh sinh hóa 4 ch ng vi khu n phân gi i canxi oxalat m nh nh t, k t qu có 3 ch ng đ u t ng đ ng loài Branhamella catarrhalis và 1 ch ng t ng đ ng loài Bacillus sphaericus.
4.2. NGH
K t qu c a đ tài là ti n đ cho các công trình nghiên c u v các h p ch t phân h y canxi oxalat có ngu n g c t vi sinh v t. hoàn thi n h n cho đ tài nghiên c u, chúng tôi có nh ng đ ngh nh m c ng c thêm k t qu mà đ tài đ t đ c c ng nh h ng phát tri n:
nh danh sinh h c phân t nh ng ch ng có ho t tính phân gi i canxi oxalat m nh.
Xác đnh b n ch t h p ch t phân gi i canxi oxalat t các ch ng phân l p. Kh o sát các y u t nh h ng đ n h p ch t c n thu nh n.
KHÓA LU N T T NGHI P TÀI LI U THAM KH O
TÀI LI U THAM KH O
TÀI LI U TI NG VI T
[1]. Nguy n Th Bay (2007), B nh h c và đi u tr n i khoa, NXB Y h c, tr. 241- 243.
[2]. Hoàng Minh Châu, T V n M c và T V ng Nghi (2002), C s hóa h c
phân tích, NXB Khoa h c và k thu t Hà N i, tr. 171-172.
[3]. Tr n T Hi u, T V ng Nghi, Nguy n V n Ri và Nguy n Xuân Trung (2007),
Hóa h c phân tích ph n 2 – các ph ng pháp phân tích công c , NXB Khoa h c và k thu t Hà N i, tr. 273-274.
[4]. Tr n V n Hinh (2013), Các ph ng pháp chu n đoán và đi u tr b nh s i ti t ni u, NXB Y h c, tr. 25-48.
[5]. Nguy n c L ng, Phan Th Huy n và Nguy n ánh Tuy t (2003), Thí
nghi m công ngh sinh h c t p 2 - Thí nghi m vi sinh v t h c, NXB đ i h c qu c gia Tp.HCM, tr. 30-34
[6]. Nguy n B u Tri u, Nguy n K , Tr n Quán Anh, Lê Ng c T , V Nguy n Kh i, Nguy n Ph ng H ng, Tr ng Thành, Nguy n Anh Tu n, Hoàng Long, Nguy n Quang, Nguy n Ti n Khanh, Ng c Thanh, Nguy n H ng Liên, L ng T n Thành, Nguy n V n Thành (2002), “ Nghiên c u ng d ng máy tán s i ngoài c th Modulith SLX đ đi u tr s i th n và s i ni u qu n t i B nh vi n Vi t c (t tháng 6/1996 đ n tháng 8/2000)”, Báo cáo t ng k t đ
tài khoa h c công ngh c p b , B nh vi n h u ngh Vi t c Hà N i n m 2002, B y t , tr. 24-31.
[7]. Gia Tuy n (2006), B nh h c n i khoa t p 1, NXB Y h c, tr. 356.
TÀI LI U TI NG ANH
[8]. Allison M. J., Dawson K. A., Mayberry W. R. và Foss J. G. (1985), “Oxalobacter formigenes gen. nov, sp. Nov. oxalat degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinal tract”, Arch Microbiol, 141(1), pp. 1-7.
[9]. Alvarado C., García Almendárez B. E., Martin S. E. và Regalado C. (2006), “Food-associated lactic acid bacteria with antimicrobial potential from
KHÓA LU N T T NGHI P TÀI LI U THAM KH O
traditional Mexican foods”, Revista Latinoamericana de microbiología, 48, pp. 260 - 268.
[10].Bhat' J. V. và Barker H. A. (1947), “Studies on a new oxalat-decomposing bacterium Vibrio oxaliticus”, Journal bacteriology, 55(3), pp. 359-368
[11].Campieri C., Campieri M., Bertuzzi V., Swennen E., Matteuzzi D., Sefoni S., Pirovano F., Centi C., Ulisse S., Famularo G. và Simone C. D. (2001), “Reduction of oxaluria after an oral course of lactic acid bacteria at high concentration”, Kidney International, 60, pp. 1097-1105.
[12]. Caudarella R., Tonello L., Rizzoli E. và Vescini F. (2011), “Predicting five- year recurrence rates of kidney stones: an artificial neural network model”,
Arch Ital Urol Androl, 83 (1), pp. 14-9.
[13].Chandra T. S. và Shethna Y. I. (1975), “Isolation and characterization of some new oxalat - decompsing bacteria”, Atonie van leeu wen hoek, 40, pp. 101- 111.
[14].Cowan and Steel's (1993), Manual for the Identification of Medical
Bacteria, Cambridge University Press, pp. 87-101.
[15].Daudon M., Hennequin C., Laucor B., Moel G. L., Donsimoni R., Fellahi S., Paris M. và Troupel S. (1995),” Sex- and age- related composition of 10617 calculi analyzed by infrared spectroscopy”, Urological resaarch, 23(5), pp. 319-326..
[16].Dawson K. A., Allison M. J. và Hartman P. A. (1980), “Isolation and some characteristics of anaerobic oxalat-degrading bacteria from the rumen”, Appl.
Environ. Microbiol, 40(4), pp. 833.
[17].Goldfarb D. S., Modersitzki F. và Asplin J. A. (2007), “A Randomized, Controlled Trial of Lactic Acid Bacteria for Idiopathic hyperoxaluria”, Clin J
Am Soc Nephrol, 2, pp. 745–749.
[18].Hoppe B., Beck B., Gatter N., Unruh G. V., Tischer A., Hesse A., Laube N., Kaul P. và Sidhu H. (2006), “Oxalobacter formigenes: a potential tool for the treatment of primary hyperoxaluria type 1”, Kidney International, 70, pp- 1305-1311.
KHÓA LU N T T NGHI P TÀI LI U THAM KH O
[19].Khambata S. K. và Bhat' J. V. (1953), “Studies on a new oxalat-decomposing bacterium Pseudomonas oxalaticus”, Journal of Bacteriology, 66 (5). pp. 505- 507.
[20].Jayasuriyg A. C. N. (1955), “The Isolation and Characteristics of an Oxalat decomposing Organism”, J. gen. Microbiol,12, pp. 419-428.
[21].Khan S. R. (1997), “Animal models of kidney stone formation: an analysis”,
World Journal of Urology, 15(4), pp. 236-243.
[22].Kiriaki K. S., Francis M. E., Jones C. A., Nyberg L. M. và Curhan G. C. (2003), “Time trends in reported prevalence of kidney stones in the United States: 1976–1994”, Kidney International, 63, pp. 1817–1823.
[23].Kodama T., Akakura K., Mikami K. và Ito H. (2002), “Detection and identification of oxalat-degrading bacteria in human feces”, International
Journal of Urology, 9, pp. 392–397.
[24].Lieske J. C., Goldfarb D. S., Simone C. D. và Regnier C. (2005), “Use of a probiotic to decrease enteric hyperoxuria”, Kidney International, 68, pp. 1244- 1249.
[25].MacFaddin J. F. (2000), Biochemical test for identification of medical
bacteria, Lippincott Williams and Wilkins, pp. 57-439.
[26].Murphy C., Murphya S., O’Briena F., O’Donoghueb M., Boileauc T., Sunvoldc G., Reinhartc G., Kielya B., Shanahand F. và O’Mahony L. (2008), “Metabolic activity of probiotics—Oxalat degradation”, Veterinary
Microbiology, 136, pp. 100–107.
[27].Sasikumar P., Gomathi S., Anbazhagan K. và Selvam G. S. (2013), “ Secretion of Biologically Active Heterologous Oxalat Decarboxylase (OxdC) in Lactobacillus plantarum WCFS1 Using Homologous Signal Peptides”,
BioMed Research International, pp. 9.
[28].Svehla G. (1996), Vogel'sQualitative Inorganic Analysis- Seventh Edition, Longman, pp. 323-325.
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
PH L C PH L C 1: HÓA CH T
H2O2 5% (B o qu n trong chai màu 4oC)
H2O2 5 mL
H2O 100 mL
Thu c nhu m Crystal violet
Dung d ch 1 Crystal violet 2 g C N 96o 20 mL Dung d ch 2 ammonium oxalat 0,8 g N c c t 80 mL
Thu c nhu m lugol
I2 1 g
KI2 2 g
N c c t đ 300 mL
Thu c nhu m Safranin O
Safranin O (dung d ch 2% trong c n 96o) 0,25 g
Ethanol 10 mL N c c t 90 ml Fuchsine ki m Dung d ch a Fuchsine ki m 0,3 g C n 96% 10 ml Dung d ch b Phenol 5 mL N c c t 35 mL C n acid
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
Etanol 95% 100 mL
HCl đ m đ c 3 mL
Dung d ch xanh Methylen
Dung d ch xanh Methylen bão hòa trong Etanol (~ 2%) 30 mL
Dung d ch KOH 0,01% trong n c
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
PH L C 2: MÔI TR NG
Môi tr ng NA (Nutrient agar)
Cao th t 5 g
Peptone 10 g
NaCl 5 g
Agar 15 g
N c c t 1000 mL
Môi tr ng lên men các lo i đ ng ( em h p kh trùng 110oC/15 – 20 phút).
NB 8 g ng 10 g Phenol red 0,01 g N c c t 1000 mL pH : 7.4 Môi tr ng th ch máu BA Môi tr ng BA t ng h p N c c t 950 mL
un tan agar, h p vô trùng 121oC/ 15 phút t vào b n nhi t 50oC/ 30 phút
B sung máu (c u ho c th ) 50 mL
pH: 7,4
Môi tr ng 1
Potassium oxalat hydrate 1 g
(NH4)2 SO4 0,5 g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,1 g FeSO4.7H2O 0,02 g CaSO4.2H2O 0,01 g Cao n m men 0,1% N c c t 980 mL
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
pH: 7
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
PH L C 3: HÌNH NH
C +
Hình 4.1. Th nghi m catalase
Hình 4.3. Th nghi m kh n ng lên men đ ng mannitol manitol
Hình 4.9. Th nghi m kh n ng s d ng nitrat
Hình 4.3. Th nghi m kh n ng tiêu huy t
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
Hình 4.4. Th nghi m oxidase Hình 4.5. Th nghi m k khí
Test 50oC Test kh n ng dung n p mu i n ng đ 10% Test kh n ng sinh tr ng 50oC Test kh n ng s d ng citrate Test kh n ng phân gi i ure
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
PH L C 4. NH DANH
nh danh c u khu n gram âm có kh n ng phân h y canxi oxalat theo khóa phân lo i Cowan and Steel’s
K C KHÓA LU nh d owan and N T T N danh Bacill Steel’s NGHI P
lus sp. có kkh n ng pphân h y caanxi oxalat
P t theo khóa PH L C a phân lo i C i
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
PH L C 5: X LÝ TH NG KÊ
1. K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v k t qu đ nh l ng mu i oxalat còn l i (g) trong 13 m u b ng ph ng pháp oxi hóa kh (KMnO4) b ng ph n m m Microsoft Excel
Anova: Single Factor
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance Standard
Error H18.3 3 0.888 0.296 0.000 0.000 H28.1 3 5.221 1.740 0.003 0.033 H21.7 3 5.221 1.740 0.003 0.033 H29.4 3 5.222 1.741 0.003 0.032 H22.4 3 5.221 1.740 0.003 0.033 H19.3 3 0.966 0.322 0.001 0.017 H20.5 3 0.947 0.316 0.001 0.020 H38.2 3 0.985 0.328 0.003 0.033 H20.9 3 0.946 0.315 0.000 0.011 H21.1 3 0.888 0.296 0.000 0.000 H19.2 3 0.907 0.302 0.000 0.006
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
H18.1 3 1.766 0.589 0.002 0.026
C 3 5.910 1.970 0.000 0.000
ANOVA
Source of
Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 19.49409831 12 1.624508192 1024.0317 0.00 2.1479 Within Groups 0.041246 26 0.001586385 Total 19.53534431 38
2. K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t v đnh l ng mu i oxalat gi m (g) trong 13 m u b ng ph ng pháp oxi hóa kh (KMnO4) b ng ph n m m STATGRAPHICS Plus 3.0.
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C
3. K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v k t qu đnh l ng mu i oxalat gi m (%) trong 13 m u b ng ph ng pháp oxi hóa kh (KMnO4) b ng ph n m m Microsoft Excel.
Anova: Single Factor
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance
Standard Error H18.3 3 255.00 85.00 0.00 0.00 H28.1 3 35.00 11.67 8.33 1.67 H21.7 3 35.00 11.67 8.33 1.67 H29.4 3 34.92 11.64 8.08 1.64
KHÓA LU N T T NGHI P PH L C H22.4 3 35.00 11.67 8.33 1.67