Xác định khoảng cộng tính 3.2.1.
Tiến hành đo lần lƣợt phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn SUL 40 mg/L, TRI 8 mg/L và dung dịch chuẩn hỗn hợp (SUL 40 mg/L + TRI 8 mg/L).
Hình 3: Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn SUL 40,0 mg/L, TRI 8,0 mg/L, phổ cộng và phổ hỗn hợp với hàm lượng SUL, TRI tương ứng.
So sánh phổ cộng của dung dịch chuẩn SUL 40 mg/L và TRI 8 mg/L với phổ hỗn hợp của hai chất trên cho thấy SUL và TRI có tính cộng tính ánh sáng trong khoảng bƣớc sóng từ 235 - 300 nm. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 200 220 240 260 280 300 320 340 Độ hấp thụ Bƣớc sóng (nm) Phổ hỗn hợp Phổ cộng SUL TRI
21
Chọn bước sóng định lượng 3.2.2.
3.2.2.3. Phương pháp đạo hàm giao điểm không
Phổ đạo hàm bậc 1:
Làm trơn phổ hấp thụ bằng chức năng Smooth sau đó lấy đạo hàm bậc 1 (
nm, Scaling factor: 100) ta đƣợc phổ đạo hàm bậc 1.
Hình 4: Phổ đạo hàm bậc 1 của dãy dung dịch chuẩn SUL (20-48 mg/L), TRI (4-9,6 mg/L) và chế phẩm bột uống Supertrim.
Trên phổ đạo hàm bậc 1, tại bƣớc sóng 247,90 nm giá trị đạo hàm của dãy dung dịch chuẩn SUL (20 - 48 mg/L) có cùng giá trị (phổ đạo hàm bậc 1 của dãy dung dịch đồng giao tại một điểm). Tại bƣớc sóng này, giá trị phổ đạo hàm của hỗn hợp SUL và TRI chỉ còn phụ thuộc vào giá trị đạo hàm của TRI. Do đó, có thể sử dụng bƣớc sóng 247,90 nm để định lƣợng TRI.
Tƣơng tự, tại bƣớc sóng 260,95 nm giá trị đạo hàm bậc 1 của dãy dung dịch chuẩn TRI (4 - 9,6 mg/L) có cùng giá trị (phổ đạo hàm bậc 1 của dãy dung dịch đồng giao tại một điểm). Tại bƣớc sóng này, giá trị phổ đạo hàm của hỗn hợp SUL và TRI
-4 -3 -2 -1 0 1 2 240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300 Đ ạo hàm b ậc 1 Bƣớc sóng (nm) SUL TRI Bột Supertrim 260,95 nm 247,90 nm
22
chỉ còn phụ thuộc vào giá trị đạo hàm của SUL. Do đó, có thể sử dụng bƣớc sóng 260,95 nm để định lƣợng SUL.
Phổ đạo hàm bậc 2:
Làm trơn phổ hấp thụ bằng chức năng Smooth sau đó lấy đạo hàm bậc 2 (
nm, Scaling factor: 100) ta đƣợc phổ đạo hàm bậc 2.
Hình 5: Phổ đạo hàm bậc 2 của dãy dung dịch chuẩn SUL (20-48 mg/L), TRI (4-9,6 mg/L) và chế phẩm viên nén Biseptol.
Trên phổ đạo hàm bậc 2, tại bƣớc sóng 255,75 nm giá trị đạo hàm của dãy dung dịch chuẩn SUL (20 - 48 mg/L) có cùng giá trị (phổ đạo hàm bậc 2 của dãy dung dịch đồng giao tại một điểm). Tại bƣớc sóng này, giá trị phổ đạo hàm của hỗn hợp SUL và TRI chỉ còn phụ thuộc vào giá trị đạo hàm của TRI. Do đó, có thể sử dụng bƣớc sóng 255,75 nm để định lƣợng TRI.
Tƣơng tự, tại bƣớc sóng 264,50 nm giá trị đạo hàm bậc 1 của dãy dung dịch chuẩn TRI (4 - 9,6 mg/L) có cùng giá trị (phổ đạo hàm bậc 2 của dãy dung dịch đồng giao tại một điểm). Tại bƣớc sóng này, giá trị phổ đạo hàm của hỗn hợp SUL và TRI
-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 235 237 239 241 243 245 247 249 251 253 255 257 259 261 263 265 267 269 Đ ạo hàm b ậc 2 Bƣớc sóng (nm) SUL TRI Biseptol 264,50 nm 255,75 nm
23
chỉ còn phụ thuộc vào giá trị đạo hàm của SUL. Do đó, có thể sử dụng bƣớc sóng 264,50 nm để định lƣợng SUL.
3.2.2.4. Phương pháp đạo hàm phổ tỷ đối
Định lƣợng SUL:
Số chia là phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn TRI 8 mg/L.
Lấy phổ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp SUL (20 - 48 mg/L) và TRI (8 mg/L) chia cho phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn TRI 8mg/L đƣợc phổ tỷ đối. Bằng cách chia tƣơng tự ta thu đƣợc phổ tỷ đối của các chế phẩm nghiên cứu.
Làm trơn phổ tỷ đối bằng chức năng Smooth, sau đó lấy đạo hàm bậc 1 ( = 4 nm, Scaling factor: 100) thu đƣợc phổ đạo hàm tỷ đối bậc 1.
Hình 6: Phổ đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn SUL (20-48 mg/L) + TRI 8 mg/L và chế phẩm viên nén Biseptol, với số chia là dung dịch chuẩn TRI 8 mg/L
Tại bƣớc sóng cực tiểu 274,70 nm dùng để định lƣợng SUL bằng phƣơng pháp đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối.
Định lƣợng TRI:
Số chia là phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn SUL 20 mg/L
-10 -5 0 5 10 15 20 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280 Đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối Bƣớc sóng (nm) SUL (20-48 mg/L) + TRI 8mg/L Biseptol 274,70 nm
24
Lấy phổ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp TRI (4 - 9,6 mg/L) và SUL (40 mg/L) chia cho phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn SUL 20 mg/L đƣợc phổ tỷ đối. Bằng cách chia tƣơng tự ta thu đƣợc phổ tỷ đối của các chế phẩm nghiên cứu.
Làm trơn phổ tỷ đối bằng chức năng Smooth, sau đó lấy đạo hàm bậc 1 ( = 4 nm, Scaling factor: 100) thu đƣợc phổ đạo hàm tỷ đối bậc 1.
Hình 7: Phổ đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn SUL 40 mg/L + TRI (4-9,6 mg/L) và chế phẩm viên nén Trimeseptol, với số chia là dung dịch chuẩn SUL
20 mg/L
Tại bƣớc sóng cực tiểu 246,60 nm dùng để định lƣợng TRI bằng phƣơng pháp đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối.
Khảo sát khoảng tuyến tính 3.2.3.
Mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ của dung dịch chuẩn SUL (20 – 48 mg/L) và TRI (4 – 9,6 mg/L) với tín hiệu đạo hàm bậc 1, bậc 2 và đạo hàm tỷ đối bậc 1 đƣợc trình bày trong bảng 4. -6 -4 -2 0 2 4 6 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 Đạo hàm bậc 1 ph ổ tỷ đối Bƣớc sóng (nm) TRI (4-9,6 mg/L) + SUL 40 mg/L Trimeseptol 246,60 nm
25
Bảng 4: Khảo sát khoảng tuyến tính
Phƣơng pháp Hoạt chất Bƣớc sóng
(nm) Phƣơng trình hồi quy R2 Đạo hàm bậc 1 giao điểm không SUL 260,95 y = 0,021x + 0,0682 0,9975 TRI 247,90 y = – 0,169x + 0,0611 0,9993 Đạo hàm bậc 2 giao điểm không SUL 264,50 y = – 0,008x – 0,0133 0,9991 TRI 255,75 y = 0,0109x – 0,0212 0,9936 Đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối SUL 274,70 y = – 0,2021x + 0,2565 0,9995 TRI 246,60 y = – 0,4755x + 0,4624 0,9959 Độ đúng, độ lặp của phương pháp 3.2.4.
Độ đúng của phƣơng pháp dựa trên phần trăm tìm lại của chất chuẩn đƣợc thêm vào các mẫu thử trong cùng điều kiện. Tiến hành khảo sát trên 3 chế phẩm (thuốc bột Supertrim, viên nang Sulfareptol và viên nén Trimeseptol), mỗi chế phẩm làm 3 mẫu thử (n=3).
Thêm chính xác đồng thời một lƣợng dung dịch chuẩn SUL và TRI tƣơng đƣơng 100% nồng độ dung dịch thử. Kết quả phần trăm tìm lại đƣợc trình bày trong bảng 5.
Bảng 5: Độ đúng, độ lặp của các phương pháp.
Chế phẩm
Phần trăm tìm lại (%)
Đạo hàm bậc 1 Đạo hàm bậc 2 Đạo hàm tỷ đối bậc 1 SUL TRI SUL TRI SUL TRI
Bột uống Supertrim 1 98,3 95,7 98,8 97,9 98,9 94,8 2 101,3 94,7 96,9 102,1 96,5 99,8 3 100,7 99,5 97,7 100,1 97,8 94,2 Viên nang Sulfareptol 1 101,5 99,0 100,7 97,3 99,0 95,6 2 98,8 97,3 99,3 96,5 101,4 96,0 3 102,8 97,6 99,6 100,8 99,2 96,1
26 Viên nén Trimeseptol 1 104,3 97,1 100,5 103,8 100,1 96,5 2 102,9 98,8 99,2 95,3 99,2 98,4 3 104,1 94,5 99,2 98,0 97,7 94,7 Trung bình 101,6 97,1 99,1 99,1 98,9 96,2 SD 2,1 1,8 1,1 2,8 1,4 1,8 RSD 2,0 1,9 1,2 2,8 1,4 1,9
Với phƣơng pháp đạo hàm bậc 2 giao điểm không, tín hiệu đạo hàm tại bƣớc sóng đinh lƣợng khá thấp (< 0,1) và độ lặp lại của phƣơng pháp không cao (RSD > 2%) nên phƣơng pháp này không đƣợc áp dụng cho định lƣợng các chế phẩm nghiên cứu.
3.3.Kết quả định lƣợng
Bảng 6: Kết quả định lượng SUL trong các chế phẩm nghiên cứu (n=3)
Chế phẩm
Hàm lƣợng phần trăm so với nhãn (Trung bình ± SD) Đạo hàm bậc 1 Đạo hàm tỷ đối
bậc 1 HPLC - DĐVN V Viên nang Sulfareptol 96,5 ± 0,7 96,3 ± 0,7 98,7 ± 0,2
Viên nén Biseptol 96,7 ± 1,6 98,7 ± 1,2 97,7 ± 0,7 Viên nén Cotrimstada 97,1 ± 1,0 97,9 ± 0,4 97,7 ± 0,5 Viên nén Trimeseptol 94,1 ± 2,0 94,3 ± 1,6 96,7 ± 0,2 Bột uống Supertrim 101,5 ± 0,5 99,5 ± 0,7 97,9 ± 0,6
Bảng 7: Kết quả định lượng TRI trong các chế phẩm nghiên cứu (n=3)
Chế phẩm
Hàm lƣợng phần trăm so với nhãn (Trung bình ± SD) Đạo hàm bậc 1 Đạo hàm tỷ đối
bậc 1 HPLC - DĐVN V Viên nang Sulfareptol 96,3 ± 0,7 101,9 ± 1,2 100,8 ± 0,4
27
Viên nén Biseptol 94,2 ± 1,8 96,5 ± 0,8 99,4 ± 0,5 Viên nén Cotrimstada 94,6 ± 1,0 98,7 ± 1,0 98,3 ± 0,3 Viên nén Trimeseptol 96,6 ± 0,3 101,0 ± 0,1 99,3 ± 0,3 Bột uống Supertrim 94,3 ± 0,5 97,2 ± 0,8 98,1 ± 0,5
Trong nghiên cứu này, HPLC theo qui định của DĐVN V đƣợc sử dụng làm phƣơng pháp đối chiếu với điều kiện sắc ký: máy sắc ký: Shimadzu LC 2030C 3D Plus; cột sắc ký: InertSustain C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) - GL Sciences Inc; pha động (nƣớc : acetonitril : triethylamin, pH 5,9); tốc độ dòng 1,8 mL/phút; thể tích tiêm 20 µL; detector DAD: 254 nm.
3.4.So sánh kết quả định lƣợng
So sánh kết quả định lƣợng của các phƣơng pháp quang phổ đạo hàm với phƣơng pháp HPLC theo qui định của DĐVN V bằng phần mềm EXCEL với kiểm định thống kê t cặp với độ tin cậy 95% (bảng 8 và 9).
Bảng 8: Kết quả so sánh bằng kiểm định thống kê t cặp (độ tin cậy 95%) giữa phương pháp đạo hàm bậc 1 giao điểm không và HPLC.
SUL TRI
Biến 1 Biến 2 Biến 1 Biến 2 Trung bình 97,8 97,2 99,2 95,1 Phƣơng sai 0,5 7,2 1,2 1,1
n 5 5 5 5
Tƣơng quan Pearson 0,4 0,7 Sai khác trung bình theo
giả thiết 0 0
Bậc tự do 4 4
t tính 0,5 10,4
p (T ≤ t) hai đuôi 0,6 5.
28
Với phƣơng pháp đạo hàm bậc 1 giao điểm không, kết quả định lƣợng SUL không có sự khác biệt với độ tin cậy 95% khi so sánh với phƣơng pháp HPLC. Tuy nhiên kết quả định lƣợng TRI bằng quang phổ đạo hàm bậc 1 nhỏ hơn đáng kể so với HPLC (p < 0,05).
Bảng 9: Kết quả so sánh bằng kiểm định thống kê t cặp (độ tin cậy 95%) giữa phương pháp đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối và HPLC.
SUL TRI
Biến 1 Biến 2 Biến 1 Biến 2 Trung bình 97,8 97,3 99,2 99,1 Phƣơng sai 0,5 4,3 1,2 5,5
N 5 5 5 5
Tƣơng quan Pearson 0,4 0,6 Sai khác trung bình theo
giả thiết 0 0
Bậc tự do 4 4
t tính 0,5 0,1
p (T ≤ t) hai đuôi 0,6 0,9 t bảng hai đuôi 2,8 2,8
Với phƣơng pháp đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong phép định lƣợng SUL và TRI khi so sánh với phƣơng pháp HPLC (p > 0,05).
Do đó, chỉ áp dụng phƣơng pháp đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối trong phép thử độ hòa tan để định lƣợng đồng thời SUL và TRI.
3.5.Thử độ hòa tan
Tiến hành thử độ hòa tan của 4 chế phẩm: viên nén Biseptol, Cotrimstada, Trimeseptol và viên nang Sulfareptol theo chuyên luận viên nén Cotrimoxazol trong DĐVN V.
29
Quy trình thử
3.5.1.
- Cho 900 mL dung dịch HCl 0,1N vào 6 bình của thiết bị thử hoà tan.
- Làm ấm môi trƣờng đến nhiệt độ 370C.
- Cho vào 6 bình thử mỗi bình một mẫu thử. Hạ cánh khuấy và cho máy chạy, thời gian thử hoà tan bắt đầu tính.
- Sau các khoảng thời gian 5; 10; 20; 30; 45; 60 phút lấy khoảng 5 mL mẫu, lọc, hút chính xác 1mL dịch lọc cho vào bình định mức 10 mL thêm dung dịch HCl 0,1N đến vạch.
- Xác định nồng độ SUL và TRI bằng phƣơng pháp quang phổ đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối.
Kết quả. 3.5.2.
Hình 8: Đường cong hòa tan của viên nén Biseptol (n = 6).
Hình 9: Đường cong hòa tan của viên nang Sulfareptol (n = 6).
Kết quả cho thấy, viên nén Biseptol và viên nang Sulfareptol hòa tan khá nhanh (hình 9 và 10). Sau khoảng 10 phút hàm lƣợng SUL và TRI hòa tan đều lớn 80%.
Sau 30 phút, cả hai viên nén Cotrimstada và Trimeseptol đều có hàm lƣợng SUL hòa tan lớn hơn 85% và TRI lớn hơn 95%. Hàm lƣợng SUL và TRI đã hòa tan ở các chế phẩm sau 60 phút đƣợc trình bày trong bảng 10:
Bảng 10: Kết quả phần trăm hàm lượng hoạt chất hòa tan so với nhãn của các chế phẩm viên nén, viên nang sau 60 phút.
00 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 % Hò a tan Thời gian (phút) Biseptol SUL TRI 00 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 % Hò a tan Thời gian (phút) Sulfareptol SUL TRI
30
Chế phẩm
Phần trăm hòa tan (Trung bình ± SD %) (n = 6)
SUL TRI
Viên nén Biseptol 103,5 ± 2,1 90,6 ± 5,1 Viên nén Cotrimstada 92,3 ± 1,4 100,0 ± 2,1 Viên nén Trimeseptol 89,7 ± 1,2 93,6 ± 2,2 Viên nang Sulfareptol 96,2 ± 2,6 93,9 ± 2,1
3.6.Bàn luận.
Theo quy định của DĐVN V, phƣơng pháp HPLC đƣợc sử dụng để định lƣợng đồng thời hỗn hợp SUL và TRI trong viên nén Cotrimoxazol. Tuy nhiên, phƣơng pháp này đòi hỏi phải sử dụng nhiều dung môi hữu cơ khi số lƣợng mẫu phân tích lớn (ví dụ: phép thử độ hòa tan…). Để tiết kiệm chi phí, phƣơng pháp đạo hàm phổ tử ngoại đã đƣợc nghiên cứu trong khóa luận này.
Trên thực tế, quang phổ UV truyền thống không thể định lƣợng đƣơc đồng thời SUL và TRI trong hỗn hợp hai thành phần do có sự đan xen của các dải phổ riêng biệt của từng thành phần (hình 4). Do vậy, phép biến đổi đạo hàm đã đƣợc áp dụng để định lƣợng trực tiếp SUL và TRI trong các chế phẩm mà không cần qua giai đoạn tách chiết từng thành phần. Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành với các thông số đƣợc lựa chọn nhƣ sau:
Phép làm trơn phổ: Denta lambda: 4 nm, Scaling factor: 1
Phép lấy đạo hàm: Denta lambda: 4 nm, Scaling factor: 100.
Với phƣơng pháp đạo hàm giao điểm không, bƣớc sóng đƣợc lựa chọn là điểm mà tại đó phổ đạo hàm của dãy dung dịch chuẩn của một trong hai chất đồng giao. Qua khảo sát, các bƣớc sóng đƣợc lựa chọn là:
Đạo hàm bậc 1: Định lƣợng SUL tại 260,95 nm, TRI tại 247,70 nm
Đạo hàm bậc 2: Định lƣợng SUL tại 264,50 nm, TRI tại 255,75 nm.
Với phƣơng pháp đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối, cƣờng độ tín hiệu phổ đạo hàm thu đƣợc phụ thuộc vào nồng độ số chia đƣợc lựa chọn. Bƣớc sóng đƣợc lựa chọn là điểm
31
mà tại đó giá trị tuyệt đối của tín hiệu đạo hàm đủ lớn và có sự phụ thuộc tuyến tính với nồng độ. Qua khảo sát, các bƣớc sóng và số chia đƣợc lựa chọn là
Định lƣợng SUL tại: 274,70 nm, số chia TRI 8 mg/L
Định lƣợng TRI tại: 246,60 nm, số chia SUL 20 mg/L.
Tuy nhiên với phƣơng pháp đạo hàm bậc 2, tín hiệu đạo hàm bậc 2 của TRI khá thấp (< 0,1) và độ lặp của phƣơng pháp không cao (RSD > 2%) nên dễ mắc sai số lớn trong quá trình định lƣợng. Vì vậy, phƣơng pháp này không đƣợc ứng dụng trong định lƣợng và thử độ hòa tan các chế phẩm nghiên cứu.
So sánh độ đúng của các kết quả định lƣợng thu đƣợc (kiểm định t cặp với độ tin cậy 95%) cho thấy: (i) không có sự khác biệt đáng kể khi định lƣợng SUL bằng các phƣơng pháp quang phổ đạo hàm và HPLC cũng nhƣ khi định lƣợng TRI bằng phƣơng pháp đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối và HPLC; (ii) phƣơng pháp phổ đạo hàm bậc 1 thƣờng cho giá trị hàm lƣợng TRI nhỏ hơn đáng kể so với HPLC. Do đó, chúng tôi chỉ áp dụng phƣơng pháp đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối trong phép thử độ hòa tan.
Kết quả định lƣợng cho thấy tất cả các chế phẩm đều có hàm lƣợng SUL và TRI đạt yêu cầu từ 93,0% đến 107,0% so với lƣợng ghi trên nhãn (theo yêu cầu của DĐVN V) và phép định lƣợng có độ lặp với RSD < 2%.
Trong phép thử độ hòa tan theo qui định của DĐVN V, tất cả các chế phẩm đều