Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập qua 2 bước chính:
- Bước 1: Thực hiện đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) thiết lập bộ dữ liệu của chất phân lập được.
- Bước 2: So sánh các dữ liệu các chất thiế t lập đó với các dữ liệu các chất đã công bố.
❖ Phổ khối lượng (MS)
Phương pháp phổ khối lượng (MS) là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu bằng cách đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí. Phổ khối lượng là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z trong đó m là khối lượng, z là điện tích. Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học.
Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau s ẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau dựa vào đó và các phương pháp phổ khác ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó chính xác [6].
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR là một phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, đặc biệt các phân tử phức t ạp như các hợp chất thiên nhiên. Phương pháp phổ NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử bằng sự tương tác bức xạ điện tử tần số radio với tập h ợp hạt nhân được đặt trong từ trường mạnh. Các hạt nhân này là một phần c ủ a nguyên tử và các nguyên tử lại được tập hợp thành phân tử.
Đặt một chất có hạt nhân lên sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: một hướng thuận chiều với từ trường và ngược chiều với từ trường, đến khi đạt đến mức độ cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Chiếu lên chất đó một bức xạ điện tử có tần s ố thích hợp, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường) nhưng khi ta ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Để thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất ta xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng). Xác định năng lượng cộng hưởng này bằng cách xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số c ộng hưởng được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét hoặc ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật xác định bằng cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier transform - NMR, FT - NMR là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay.
Dựa vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc mà thực hiện đo một hay nhiều loại phổ khác nhau như: xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hoặc các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY). Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh, vậy nên đỉnh này
có thể là đỉnh đơn, đôi, ba… thành phần. Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh từ đó có thể biết số lượng proton của đỉnh đó.
Tương tư như phổ proton, phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C- NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon. Dựa vào khoảng chuyển dịch ta có thể biết được cấu trúc của nó: trong khoảng 0 - 60ppm thường là các carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố, chuyển dịch trong khoảng 45 - 85ppm là carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether), ngoài ra carbon lai hóa sp2 chuyển dịch trong khoảng 100 - 150ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm. Phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon của phân tử hoặc nhiều hơn 1 carbon nếu có chung môi trường hóa học.
Kỹ thuật DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer) giúp xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận (kỹ thuật HSQC) hoặc giữa các carbon xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY) [5].
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất
Ngâm chiết mẫu lá cây Khôi đốm (2,5 kg) sau khi qua xử lý, rửa sạch, phơi khô bằng dung môi ethanol 80% (3 lần, mỗi lần 8L) ở nhi ệt độ phòng (ngập trên dược liệu khoảng 2 - 3cm). Đậy nắp bình và ngâm ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Rút thu lấy dịch chiết lần một, bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2 -3cm thu lấy dịch chiết lần 2 và tương tự như thế thu lấy dịch chiết lần 3.
Lọc các dịch chiết ethanol thu được qua gi ấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được khoảng 150g cao chiết toàn phần.
Phân tán 100g cao chiết toàn phần trong nước cất nóng với tỷ lệ thể tích cao đặc trên nước cất nóng là 1:1 thu được dịch chiết nước. Dịch chiết nước đem lắc với dung môi n-hexan khoảng 500ml/1 lần trong 3 lần thu được phân đoạn dịch chiết n-hexan. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm và cô quay cách thủy ở nhiệt độ 60oC thu được cắn của phân đoạn n-hexan (9,2g) ký hiệu là H.
Hình 3.1: Sơ đồ chiế t xuất lá cây Khôi đốm phân đoạn n-hexan
❖ Giai đoạn phân lậ p 1:
Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel với sắc ký cột cỡ hạt 0,063 - 0,200mm (Merck).
Chuẩn bị cột:
- Cộ t sắc ký có đường kính 5 cm, được lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạ ch bằng cồn.
- Chất nhồi cột: Silicagel được hoạt hóa ở 100oC/2h trong tủ sấy rồi lấy ra để nguội trong bình hút ẩm.
- Lót 1 lớp bông ở đáy cột, đổ vào cột 40ml dichlomethan, mở khóa cho dung môi chảy từ từ để đẩy hết bọt khí trong lớp bông ra ngoài. Khi l ớp dung môi còn khoảng 3cm thì khóa cột.
- Nhồi cột: trộn silicagel với một lượng vừa đủ dung môi dichlomethan thành hỗn dịch rồi đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt, rửa thành cột bằng dichlomethan. Chiều dài cột silicagel là 15cm.
- Ổn định cột: kiểm tra để đảm bảo cột ở vị trí thẳng đứng, nén cột bằng cách dùng quả bóp cao su gõ nhẹ, đều, đố i xứng xung quanh thân cột tới khi không còn bọt khí trong cột, để cột ổn định.
Tiến hành sắc ký cột hấp phụ:
- Mở khóa cột cho dung môi dichlomethan chảy đến sát bề mặt silicagel, khóa cột lại.
- Đưa chất lên cột: 8g cắn n-hexan được phân lập trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel sử dụng hệ dung môi n-hexan : dichloromethan (15:1; v/v). Điều chỉnh tốc độ rửa giải 1ml/phút.
- Hứng dịch rửa giả i vào các ống và kiểm tra bằng SKLM, gộp các ống từ 2- 16, thu được phân đoạn H1, gộp các ống từ 17 - 20, thu được phân đoạn H2, tương tự thu được phân đoạn H3.
❖ Giai đoạn phân lập 2:
Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel với sắc ký cột cỡ hạt 0,063 - 0,200mm (Merck).
Ti ế n hành chuẩn bị cột tương tự như giai đoạn 1 với cột sắc ký có đường kính 3cm.
- Tiến hành sắc ký cột cắn phân đoạn H1 với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi n-hexan : dichloromethan (10:1; v/v), kiểm tra các ống hứng
dịch rửa bằng SKLM, gộp các ống có cùng thành phần và bốc hơi dung môi thu được 4 phân đoạn nhỏ gồm H1.1, H1.2, H1.3, H1.4.
- Phân đoạn H1.1 được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan : ethylacetat (10:1; v/v) thu được hợp chất ký hiệu NS1 (12 mg). Phân đoạn H1.2 được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan : dichlometan (5:1; v/v) thu được hợp chất ký hiệu hợp chất NS2 (18mg).
Hợp chất NS1: Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol)
Tinh thể có màu trắng đục, tnc = 285 0C, Rf = 0,45 (dichloroform : methanol, 8:1). Hợp chất NS1 phản ứng với thuố c thử H2SO4 10%/EtOH cho màu hồng tươi rồi chuyển dần xanh tím. IR (KBr, cm-1) 3430 (OH), 2938 (C- H), 1635 (C = CH), 1077 (C-O-C), 1021 (C-O-C). ESI-MS:m/z 599,1 [M+Na]+.
Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất NS1 và chất tham khảo được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của NS1
và chất tham khảo [11, 25] Vị trí C DEPT 1 2 3 4 5
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4'
6'
a )
đo trong CDCl3, b )100 MHz, c )300 MHz, G) của chất tham khảo daucosterol
Hình 3.2: Cấu trúc củ a hợp chất NS1
Hợp chất NS1 phản ứng với thuốc thử H2SO4 10 %/EtOH cho màu hồng tươi rồi chuyển xanh tím dần chứng tỏ NS1 thuộc nhóm sterol. Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở v*max 3430 cm-1 đặc trưng cho nhóm O-H; đỉnh ở v*max
2938 cm- 1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-H; đỉnh
ở v*max 1635 đặc trưng cho liên kết >C=C<; đỉnh ở v*max 1077, 1021 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-C. Phổ khối ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử
ở m/z: [M+Na]+ =599,1 tương ứng với khối lượng phân tử M = 576. Điều này phù hợp với khối lượng và công thức phân tử của hợp chất NS1. Mặt khác phổ 1H-NMR có các tín hiệu đặc trưng cho hợp phần β-D-Glucozit như: 8 tín hiệu đặc trưng cho 8 nguyên tử hidro, trong đó tín hiệu ở 3,25 ppm (m, 2H) đặc trưng cho H-3', tín hiệu ở 3,44-3,48 (m, 2H) đặc trưng cho H-2', H-5'. Đối với hợp phần β-Sitosterol: gồm 20 tín hiệu đặc trưng cho 20 nguyên tử hidro, trong đó tín hiệu ở 0,68 (s, 3H) đặc trưng cho H-13, tín hiệu ở 0,78-0,88 (m, 9H) đặc trưng cho 3 nhóm CH3 tại vị trí 25 và 28. Phổ 13C-NMR của chất
hiệu của một đường glucose, các tín hiệu đặc trưng như tín hiệu tại 140,4 và 121,2ppm thuộc về liên kết đôi tại vị trí C5 và C6, tín hiệu tại 100,9ppm là carbon anomeric của đường.
Từ các kết quả nêu trên so sánh với dữ liệu phổ đã công bố [11,25] hợp chất NS1 được xác định là: Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (hay còn gọi là daucosterol).
Hợp chất NS2: Stigmasterol
Tinh thể hình kim màu trắng, tnc = 170-172 oC.
Phổ ESI-MS: m/z 395,2 [M+H-H2O]+ , Công thức phân tử: C29H48O (M = 412).
Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT củ a chất NS2 và chất tham khảo [35] được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: Dữ liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của NS2
và chất tham khảo [35] Vị trí C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 a )
đo trong CDCl3, b )100 MHz, c )400 MHz, G) của chất tham khảo stigmasterol
Hợp chất NS2 dạng tinh thể hình kim màu trắng, tnc = 170-172oC. Phổ khối lượng ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 395,2 [M+H-H2O]+ tương ứng với công thức phân tử là C29H48O (M = 412).
Phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của hai nhóm thế methyl bậc ba 0,85 (s, H-18); 1,02 (s, H-19), ba nhóm thế methyl bậc hai 0,92 (d, J=6,5 Hz, H- 21); 0,83 (d, J=6,8 Hz ; H-28); 0,79 (d, J=9,5 Hz; H-29) và một nhóm thế methyl bậc một 0,83 (t, J=8,5Hz; H-26). Trên phổ cũng xác nhận sự có mặt của nhóm –OH tại C-3 3,52 (m, H-3) và hai cặp nối đôi tại C-5/C-6 5,36 (1H, brd, J=3,5 Hz; H-6); C-22/C-23 5,16 (1H, dd, J=15,0; 8,5 Hz; H-22); 5,03 (1H, dd, J=15,05; 8,5 Hz, H-23).
Ph ổ 13 C-NMR của NS2 xuất hiện 29 tín hiệu được xác định là thuộc vào một khung sterol. Căn cứ vào những tín hiệu trên các phổ DEPT ta thấy có 6 nhóm methyl tại 12,1 (C-18); 19,4 (C-19); 21,1 (C-21); 21,2 (C-26); 25,3 (C-28); 12,2 (C-29); 9 nhóm methylen tại 37,3 (C-1); 31,6 (C-2); 42,3 (C-4); 31,8 (C-7); 21,1 (C-11); 39,7 (C-12); 24,5 (C-15); 28,9 (C-16); 31,9(C-25);
14); 56,1 (C-17); 40,6 (C-20); 138,2 (C-22); 139,3 (C-23); 51,2 (C-24); 19,1(C-27) và 3 carbon bậc bốn tại 140,7 (C-5); 36,6 (C-10); 42,2 (C-13).
Kết hợp so sánh phổ NMR giữa NS2 và stigmasterol [35] thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng. Như vậy, NS2 được xác định là
stigmasterol.
Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất NS2
3.2. Bàn luận
Kết quả đề tài đã phân lập được 2 hợp chất từ phân đoạn n-hexan là Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) và Stigmasterol bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi EtOH, sau đó xác định cấu trúc thông qua kết quả đo góc quay cực riêng, nhiệt độ nóng chảy, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân so với dữ liệu phổ công bố của các chất liên quan. Đây đều là hai chất lần đầu tiên phần lập được từ lá cây Khôi đốm tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định.
• Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol): Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Jiang L., Yang N. vào năm 2014 [31] daucosterol có khả năng thúc đẩy sự tăng sinh của các tế bào gốc thần kinh. Tế bào gốc thần kinh (NSC) là các tế bào có khả năng tự tái tạo nhưng bị hạn chế. Kết quả nghiên cứu cho thấy daucosterol làm tăng đáng kể số lượng tế bào, có tác dụng như yếu tố làm tăng trưởng nguyên bào sợi
và các yếu tố giúp tăng trưởng biểu bì tạo tiền đề cho việc ứng d ụng trong y học lâm sàng và sử dụng daucosterol thay thể yếu tố tăng trưởng hiệu quả với chi phí thấp [31, 33]. Ngay sau đó, vào năm 2015 [32], các nhà khoa học này đã thiết kế nghiên cứu về tác động của daucosterol đối với sự sống sót của các tế bào thần kinh bị thiếu oxy và glucose, mô phỏng tái cấu trúc (OGD/R) cho thấy sau khi điều trị bằng daucosterol đã làm giảm đáng kể sự suy giảm của tế bào thần kinh. Daucosterol tăng mức độ biểu hiện của protein IGF1, làm giảm sự điều hòa của p-AKT và p-GSK-3β, do đó kích hoạt đường dẫn tín hiệu AKT. Tác dụng bảo vệ thần kinh của daucosterol bị ức chế khi có picropodophyllin (PPP), chất ức chế thụ thể của yếu tố tăng trưởng giống như insulin (IGF1R). Daucosterol có thể được phát triển như một loại thuốc điều trị đột quỵ do thiếu máu cục bộ [32].
Ngoài ra, Daucosterol còn được nghiên cứu có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư [14, 22]. Năm 2015, ChuankeZhao và các đồng nghiệp đã thiết k ế nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả chống ung thư của daucosterol đối với sự tăng sinh của tế bào ung thư trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy daucosterol ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và dòng tế bào ung thư dạ dày MGC804, BGC 823và AGS [36]. Đầu năm 2019, Ping Gao và Xiaopeng Huang công bố nghiên cứu về tác dụng ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư tuyến ti ền liệt thông qua việc kích hoạt JNK, mở ra những hướng đi