Phương pháp đường chuẩn
Pha dãy chất chuẩn iridoid với các nồng độ lần lượt là: 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 mg/ml. Đo độ hấp thụ quang của các mẫu tại bước sóng 609 nm và lập đồ thị biểu thị sự phụ thuộc của A theo C [6,14].
Pha mẫu cao lá mơ với n ồng độ 12,5; 25; 40 mg/ml. Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử tại bước sóng 609 nm và dựa vào đường chuẩn đã dựng được, ta xác định được nồng độ iridoid có trong mẫu thử Cx [6,14].
Quá trình thực nghiệm sử dụng thuốc thử Trim – Hill (10 ml acid acetic + 1 ml CuSO4 0,2% + 0,5 ml HCl 1%) để đo độ hấp thụ quang [14].
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chiết xuất
- Khối lượng dược liệu tươi: 2000 g.
- Khối lượng dược liệu khô: 253,18 g.
- Giá trị hàm ẩm của dược liệu khô: 10,81%.
- Khối lượng cao thu được: 29,22 g.
- Hiệu suất chiết: 12,94%.
- Hiệu suất chiết được tính theo theo công thức:
H= ∗100∗100 ∗(100− ) Trong đó:
a: Khối lượng cao.
b: Khối lượng dược liệu khô.
x: Giá trị hàm ẩm (10,81%)
3.2. Phân tích định tính các nhóm chất hữu cơ có trong cao lá mơ
3.2.1. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
Sử dụng các phản ứng thông thường để định tính các nhóm chất hữu cơ được trình bày trong các tài liệu [2,4 ], được kết quả trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong mẫu cao lá mơ bằng phản ứng hóa học STT Nhóm chất 1 Iridoid 2 Flavonoid 3 Saponin 4 Tanin 5 Steroid 6 Tinh dầu 7 Đường khử 8 Terpennoid 9 Alkaloid 10 Anthraquinon
Ghi chú: (-): phản ứng âm tính, (+): phản ứng dương tính, (++): phản ứng dương tính rõ.
Nhận xét: Dựa vào phương pháp định tính bằng các phảnứng hóa học, ta có thể sơ bộ kết luận trong lá mơ lông có chứa các nhóm chất: Iridoid, tanin, tinh dầu, terpennoid, alkaloid, anthraquinon; không phát hiện sự có mặt của các nhóm chất: Flavonoid, saponin, steroid, đường khử.
3.2.2. Kết quả phân tích định tính iridoid bằng sắc ký lớp mỏng
Hình 3.1. Sắc ký đồ pha đảo của mẫu cao lá mơ với hệ dung môi MeOH-H2O ở các tỷ lệ lần lượt là 1:2 (A), 2:1 (B), 1:1 (C)
Nhận xét: Dựa vào hìnhảnh sắc ký đồ ởtrên, ta chọn được hệdung môi MeOH-H2O (1:2) cho kết quả tách các chất tốt nhất.
Nhận xét: Sau khi phun thuốc thử H2SO4 rồihơ nóng bản mỏng, thấy xuất hi ệ nmàu xanh dương và màu nâu, đặc trưng cho thành phần iridoid [4].
3.2.3. Kết quả phân tích định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Ta có hình ảnh sắc ký đồ HPLC của mẫu cao
Hình 3.3. S ắc ký đồ HPLC của mẫu cao lá mơ
Nhận xét: Hình ảnh sắc ký đồ cho tín hiệu rõ nét, các chất có trong mẫu cao được tách riêng rẽ. Hình ả nh này cho thấy tính đặc hiệu của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Hình 3.4. Phổ UV của chất có thời gian lưu 6,099 phút
Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 325 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất flavonoid [4,13].
Hình 3.5. Phổ UV của chất có thời gian lưu 10,212 phút
Chất này hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng khoảng 325 nm, có thể sơ bộ kết luận chất này thuộc nhóm chất flavonoid [4,13].
Hình 3.6. Phổ UV của chất có thời gian lưu 11,146 phút
Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng kho ảng 325 nm, có thể sơ bộ kết luận chất này thuộc nhóm chất flavonoid [4,13].
Hình 3.7. Phổ UV của chất có thời gian lưu 15,039 phút
Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 235 nm, có thể sơ bộ kết luận chất này thuộc nhóm chất iridoid [4,19]
Hình 3.8. Phổ UV của chất có thời gian lưu 15,872 phút.
Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng kho ảng 260 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất anthraquinon [4].
Hình 3.9. Phổ UV của chất có thơi gian lưu 16,532 phút.
Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 265 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất anthraquinon [4].
Hình 3.10. Phổ UV của chất có thời gian lưu 17,012 phút
Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng kho ảng 235 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất iridoid [4,19]
Hình 3.11. Phổ UV của chất có thời gian lưu 18,539 phút
Chất này hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng khoảng 330 nm, có thể sơ bộ xác định chất này thuộc nhóm chất flavonoid [4,13].
Nhận xét: Dựa vào phổ UV của các chấtứng với từng thời gian lưu, sơ bộ xác định được mẫu cao có chứa các chất thuộc các nhóm anthraquinon, flavonoid, iridoid.
3.3. Định lượng iridoid toàn phần có trong mẫu cao lá mơ
Bảng 3.2. Nồng độ và giá trị độ hấp thụ quang tương ứng của mẫu chuẩn iridoid Nồng độ (mg/ml) Giá trị A 0.8 0.7 qu an g 0.6 0.5 th ụ 0.4 hấ p 0.3 Đ ộ 0.2 0.1 0 0
Hình 3.12. Đồ thi miêu tả tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng
Ta có phương trình hồi quy tuyến tính của iridoid toàn phần giữa độ hấp thụ quang tại bước sóng 609 nm và nồng độ dung dịch là: y = 0,7631x – 0,0045 với hệ số R2 = 0,9995. Dựa vào mật độ quang đo được của mẫu thử và dữ liệu đường chuẩn ở trên, tính được nồng độ của iridoid trong mẫu thử và hàm lượng iridoid trong mẫu cao đặc, được kết quả trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lượng iridoid trong mẫu cao tính được dựa vào độ hấp thụ quang của mẫu thử Nồng độ mẫu thử (mg/ml) 12,5 25 40
Hàm lượng iridoid trong mẫu cao được tính theo công thức:
X= ×100 Trong đó:
a: Nồng độiridoid trong mẫu thử tính được dựa vào phương trình đường chuẩn.
b: Nồng độdung dịch mẫu thử
X: Hàm lượng iridoid trong mẫu cao (%)
Nhận xét: Như vậy hàm lượng iridoid trong mẫu cao lá mơ được xác định khoảng 2,5%.
3.4. Bàn luận
3.4.1. Về chiết xuất cao toàn phần từ mẫu lá mơ
Từ mẫu lá mơ lông được thu mua tại chợ Bưởi, Hà Nội, đã tiến hành sấy khô và sử dụng phương pháp chiết lạnh để chiết xuất và cô lấy cao đặc. Mẫu được đem chiết 3 lần bằng cồn 80 độ, mỗi lần chiết trong vòng 1 ngày. Phương pháp này có ưu điểm đơn giản, dễ thực hi ệ n, thiết bị rẻ tiền tuy nhiên hiệu suất chiết chưa cao. Kết quả, từ 2000 g mẫu tươi, sấy khô thu được 253,18 g mẫu khô, đem chiết xuất và thu được 29,22 g cao đặc. Lượng cao đặc đạt tỉ lệ 11,54% so với lượng mẫu khô và hiệu suất chiết đạt 12,94%.
3.4.2. Về định tính mẫu cao lá mơ
Khóa luận đã tiến hành định tính mẫu cao lá mơ dựa theo phương pháp hóa học được trình bày trong các tài liệu Dược liệu học và Thực tập dược liệu. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh tuy nhiên kết quả của
phản ứng có thể bị ảnh hưởng bởi chất lượng hóa chất, độ nhạy của phản ứng cũng như thao tác thực nghiệm. Kết quả của phép định tính thống nhất với các tài liệu trong và ngoài nước về cây mơ tam thể khi chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất iridoid, anthraquinon, alkaloid, terpennoid, tinh dầu. Nhóm cũng đã sử dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để xác định sự có mặt của nhóm chất iridoid trong mẫu cao.
Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành định tính mẫu cao b ằ ng việc sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả cho thấy, ngoài các chất thuộc nhóm iridoid và anthraquinon, còn phát hiện được thêm các chất thuộc nhóm flavonoid. Đây là một phát hiện rất quan trọng nhưng cần phải có thêm những kỹ thuật khác để thẩm định tính chính xác của kết quả này.
So với những nghiên cứu trước đây của PGS.TS Lê Ngọc Quang cùng cộng sự về cây mơ lông, việc sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hi ệu năng cao để định tính mẫu cao cũng là một điểm mới của đề tài khóa luận này. Tuy nhiên cần sử dụng thêm các chất chuẩn vào phương pháp này để định tính cũng như định lượng các chất cụ thể có trong mẫu cao.
3.4.3. Về định lượng iridoid toàn phần
Về định lượng, nhóm đã sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng iridoid toàn phần trong mẫu cao lá mơ. Đây cũng là một điểm mới của đề tài. Trước đó, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào đi vào định lượng các thành phần hóa học có trong cây mơ lông. Phương pháp này được thực hiện khá nhanh và đơn giản nhưng kết quả cũng bị ảnh hưởng bởi thao tác thực nghiệm và tính chính xác của máy đo độ hấp thụ quang. Hàm lượng iridoid trong mẫu cao được xác định khoảng 2,5%. Để định lượng chính xác hàm lượng của nhóm chất iridoid có trong mẫu lá mơ lông, cần phải tách và sử dụng chất chu ẩn để định lượng được hàm lượng của từng chất riêng biệt trong nhóm chất này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Qua thời gian nghiên cứu đề tài, nhóm nghiên cứu đã thu được mộ t số kết quả phù hợp với mục đích nghiên cứu ban đầu như sau:
Đã thu mẫu lá mơ lông và sử dụng phương pháp chiết lạnh để tiến hành chiết xuất mẫu khô và thu lấy cao đặc. Kết quả từ 2000 g mẫu tươi, thu được 253,18 g mẫu khô và 22,29 g cao đặc. Lượng cao đặc chiếm 11,54% so với lượng mẫu khô và hiệu suất chiết đạt 12,94%.
Đã định tính được sơ bộ các nhóm chất có trong cây mơ lông bằng việc sử dụng các phản ứng hóa học, kỹ thuật sắc ký lớp mỏ ng. Kết quả của phép định tính phù hợp với các tài liệu tham khảo nói về cây mơ tam thể khi chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất chất iridoid, anthraquinon, alkaloid, terpennoid, tinh dầu. Ngoài ra còn phát hiện thêm sự có mặt c ủa nhóm chất flavonoid khi định tính bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Đã định lượng được hàm lượng iridoid toàn phần có trong cây mơ lông bằng phương pháp đường chuẩn. Kết quả, hàm lượng iridoid trong mẫu cao được xác định khoảng 2,5%.
Tuy nhiên, do điều kiện thời gian thực hiện nghiên cứu còn ngắn, phương pháp nghiên cứu còn tương đối đơn giản, thao tác thực nghiệm đôi khi chưa thật chuẩn xác cùng một số yếu tố khách quan khác, kết quả nghiên cứu vẫn còn một số hạn chế nhất định. Có thể kể đến như:
Do sử dụng phương pháp chiết xuất đơn giản nên hiệu suất chiết chưa cao.
Các phép định tính m ới chỉ phát hiện được các nhóm chất chung chứ chưa đưa ra được các chất cụ thể.
Đã phát hiện và định lượng được hàm lượng iridoid toàn phần có trong mẫu cao nhưng chưa tách cũng như định lượng được các chất cụ thể trong nhóm chất này.
Kiến ngh ị
Trên đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên trong nội dung nghiên cứu thành phần hóa học của cây mơ tam thể. Ngoài những kết quả đã có được, nghiên cứu vẫn còn khá nhiều hạn chế. Để khắc phục những hạn chế này, đề tài cần tiếp tục:
Tiếp tục nghiên cứu tối ưu quy trình chiết hoặc sử dụng phương pháp chiết khác nhằm nâng cao hiệu suất chiết.
Tiến hành chiết xuất phân đoạn mẫu cao toàn phần đã có được với các dung môi như ethyl acetat, butanol, n-hexan để nghiên cứu cụ thể hơn các thành phần hóa học của mẫu.
Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột, sắc ký khối phổ để tiến hành phân l ậ p ra các hợp chất tinh khiết.
Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng một số chất cụ thể thuộc nhóm chất iridoid có mẫu lá mơ.
Xây dựng một số mô hình sinh học để đánh giá thêm về tác dụng dược lý của lá mơ lông.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Tiến Bân chủ biên (2003), Danh mục các loài thực vật Vi ệt Nam, Tập II, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 1063-1093.
2. Bộ môn Dược liệu (2010), Thực tập Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội.
3. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Hà Nội.
4. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, tập 1 và 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
5. Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượngthuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr. 107–113, tr. 216- 250.
6. Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr. 75-76.
7. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá họccây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr. 8-99, 162-196, 234-242.
8. Trần Ngọc Ninh (1987), “Góp phần vào việc thống kê những loài thực vật có ích thuộc họ cà phê (Rubiaceae Juss) ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 9(2), 40-44.
9. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập chất hữu cơ, Nhà xuất bản
ĐHQG TP HCM, tr. 151 -451.
10. Trần Nhật Phương (2008), Học phần kỹthuật Công NghệSinh Học Proteomic-Sắc ký, tr. 12.
11. Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hoá phân tích (2006), Hoá phân tích II, tr. 17, 99-146, tr. 173-222.
12. Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từthảo dược, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thu ật, tr. 199 – 222; 493 – 685.
B. Tài liệu tiếng Anh
13. Ann E. Stapleton, Virginia Walbot (2008), “Flavonoids Can Protect Maize DNA from the Induction of Ultraviolet Radiation Damage”, Plant Physiology, 105(3), 881-889.
7-tang on lipopolysaccsaride-induced acute lung injury in rats”, Brazilian Journal ofMedical and Biological Research, 50, 591-595.
15. Dang Ngoc Quang and Le Huy Nguyen (2009), “Anthraquinones andcumarin from the roots of Paederia scandens”, Journal of
Chemistry(Vietnam), 47, 428.
16. Dang Ngoc Quang (2009), “Anthraquinones from the roots of Paederiascandens”, Journal of Chemistry (Vietnam), 47, 95-98.
17. Dang Ngoc Quang, Toshihiro Hashimoto, Masami Tanaka, NguyenXuan Dung, Yoshinori Asakawa (2002), “Iridoid glucosides from roots of Vietnamese Paederia scandens”, Phytochemistry, 60, 505-514.
18. Goevarts R, M Ruhsam, L Andersson, E Robbrecht, D Bridson, A Davis, I Schanzer, B Sonke (2006), “World checklist of Rubiaceae”, Royal BotanicGardens, 25(3), 52-55.
19. Jefferson Rocha de Andrade, Ana Claudia Fernandes (2007), “Quantitative
determination by HPLC of iridoids in the bark and latex of Himatanthus sucuuba”, ACTA AMAZONICA, 37, 119-122.
20. Inouye H., Shimokawa, N. and Okigawa, M., (1969), “Studieson monoterpene glucosides”, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 17, 1942-1948.
21. Inouye, H., Okigawa, M. and Shimokawa (1969), “Studies on monoterpeneglucosides - Artefacts formed during extraction of asperuloside andpaederoside” Chemical Pharmaceutical Bulletin, 17, 1949-1954.
22. Inouye, Saito, S., Taguchi, H. and Endo (1969), “Zwei neueiridoidglucoside aus gardenia jasminoides: gardenosid und geniposid”
Tetrahedron Letters, 28, 2347-2350.
23. Kapadia G., Shukla, Y. N., Bose, A. K., Fujiwara, H. and Lloyd, H.A (1979), “Revised structure of paederoside, a novel monoterpene Smethyl thiocarbonate”, Tetrahedron Letters, 22, 1937-1938.
24. Rajesh Kumar Soni, Raghuveer Irchhaiya, Vihangesh Dixit (2017), “Paederia foetida linn: phytochemistry, pharmacological and traditional uses”,
Interational journal of pharmaceutical sciences and research, 4, 4525-4530.
25. Sasidharan S, Chen Y, Saravanan D, Sundram KM, Latha Y (2011), “Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants extracts”, Afr J Tradit Complement Altern Med, 8, 1-10.
26. Shukla Y., Lloyd, H. A., Morton, J. F. and Kapadia, G. J. (1976) “Iridoid
27. Takhtajan A.L (1997), “Diversity and Classification of Flowering Plants, Columbia University Press”, New York, USA.