Dựa vào hướng dẫn “Văn bản thẩm định quy trình phân tích” của Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm dành cho con người (ICH) vào năm 1997 [12], tiến hành như sau:
Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp: Cân khoảng 25mg từng chất chuẩn vào bình định mức 50ml, thêm 25ml methanol, lắc cho tan hoàn toàn. Thêm methanol vừa đủ đến vạch. Lắc kỹ. Hút 200µg bằng pipetman vào bình định mức 10ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,20µm.
Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp các corticoid vào hệ thống HPLC và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên. Ghi kết quả về tR, diện tích pic, hệ số bất đối của pic, hệ số phân giải. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1, 3.2, 3.3.
Thời gian chạy sắc ký cho tới khi chuẩn cuối cùng ra hết là khoảng 20,5 phút. Thứ tự các chuẩn trên SKĐ thể hiện ở hình 3.1.
Prednisolon
1 - 2,537
Betamethason dipropionat 3 – 19,56
Bảng số liệu:
Bảng 3.1. Kết quảkhảo sát tính thích hợp của hệthống HPLC với dexamethasonacetat Lần tiêm 1 2 3 4 5 6 RSD (%)
Bảng 3.2. Kết quảkhảo sát tính thích hợp của hệthống HPLC với betamethasondipropionat Lần tiêm 1 2 3 4 5 6 RSD (%)
Bảng 3.3. Kết quảkhảo sát tính thích hợp của hệthống HPLC với prednisolon Lần tiêm 1 2 3 4 5 6 RSD (%)
Nhận xét: Các giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%, điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng phân tích mẫu để cho kết quả tin cậy. Độ phân giải giữa hai pic liền kề đều rất cao chứng tỏ các pic tách nhau rất tốt. Hệ số bất đối của cả 3 pic đều xấp xỉ bằng 1 chứng tỏ cả 3 pic đều cân đối.
- Xác định LOD
Cách xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N). Trong đó:
S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích. N là nhiễu đường nền.
+ Dexamethason acetat
Theo SKĐ, pic chất chuẩn dexamethason acetat nồng độ 12,8µg/ml có tỷ lệ S/N = 134. Vậy có thể coi pic có S/N=10 tương đương với dung dịch nồng độ là 0,95µg/ml, do đó ta có:
LOQ = 0,95µg/ml.
LOD = 0,95/3,3 = 0,29µg/ml.
+ Betamethason dipropionat
LOQ = 3,07µg/ml.
LOD = 3.07/3,3 = 0,93µg/ml.
+ Prednisolon
Theo SKĐ, pic chất chuẩn prednisolon nồng độ 10µg/ml có tỷ lệ S/N = 145. Vậy có thể coi pic có S/N=10 tương đương với dung dịch nồng độ là 0,69µg/ml, do đó ta có:
LOQ = 0,69µg/ml.
LOD = 0,69/3,3 = 0,21µg/ml.
Nhận xét: LOD và LOQ của 3 chất phân tích có giá trị gần với giá trịLOD và LOQ của phương pháp đã chọn [11].
- Khảo sát tính phù hợp với mẫu có chứa chất phân tích
Cách đánh giá:
Khảo sát mẫu có chứa corticoid: sử dụng mẫu kem thuốc bôi da Korcin có chứa dexamethason acetat. So sánh tR, phổ đồ, phổ UV-Vis của pic mẫu với pic chuẩn tương ứng.
Tiến hành:
Tiến hành xử lý mẫu kem thuốc bôi da Korcin có chứa corticoid như phần xử lý mẫu và tiến hành sắc ký như mục 2.4.
Kết quả:
SKĐ của mẫu thử kem Korcin có pic với tR, phổ đồ, phổ UV-VIS, tương đương với pic dexamethason acetat của mẫu chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện, thể hiện ở hình 3.2; 3.3; 3.4 và 3.5.
Hình 3.2. SKĐmẫu thửkem Korcin và mẫu chuẩn
Hình 3.3. Pic trongSKĐmẫu thửkem Korcin và mẫu chuẩn
Nhận xét: So sánhSKĐvà phổ đồdung dịch mẫu thửvới dung dịch chuẩn hỗn hợp.
+ Thời gian lưu:
tR của pic trong mẫu thử kem korcin và tR của pic dexamethason acetat trong mẫu chuẩn hỗn hợp chênh lệch nhau không đáng kể là 6,430 phút (trong mẫu thử) và 6,420 phút (trong mẫu chuẩn). Như vậy tR của pic bị ảnh hưởng không đáng kể bởi nền mẫu thử, kết quả có thể chấp nhận được.
+ Phổ UV-VIS có λ max là 241,5 nm (trong mẫu thử) và 241,3 nm (trong mẫu chuẩn). Sự chênh lệch là không đáng kể.
So sánh phổ ở dải sóng 190-800 nm của dexamethason acetat trong mẫu thử và mẫu chuẩn, kết quả có sự tương đồng rất cao thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. PhổUV-VIS của mẫu thửvà mẫu chuẩn với dexamethason acetat Tổng hợp những nhận xét và đánh giá trên cho thấy hệ thống HPLC với phương pháp xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã chọn, thích hợp, đủ tin cậy để định tính 3 chất khảo sát trong thành phần kem dùng ngoài.