Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn Lâm và Khoa học Công nghệ Việt Nam, trên 3 dòng tế bào ung thư Hep – G2, Hela, LU – 1 và tế bào thường Vero. Việc chọn 3 dòng tế bào ung thư trên do chúng thuộc phổ tác dụng của doxorubicin.
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp MTT của Skehan & cs. (1990) và Likhiwitayawuid & cs. (1993) được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
Chất chuẩn chứng dương tính được dùng là chất chuẩn có khả năng diệt tế bào:
Taxol pha trong DMSO.
Tính kết quả:
- Kết quả được đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495 - 515nm.
- Giá trị CS (Cell Survival): là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó
của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:
- Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ
= √∑( − ̅)2 − 1
- Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm
tiếp để tìm giá trị IC50.
- Cách tính giá trị IC50: dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương
trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.
- Công thức: 1/y = a + blnX
- Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%)
2.4.5. Phương pháp xử lí số liệu
Sử dụng phần mềm Origin phiên bản 8.5 để:
- Vẽ phổ FTIR từ các giá trị đo được trên máy IMPACT - 410 – NICOLET.
- Vẽ đồ thị so sánh khả năng tạo nhiệt cảm ứng giữa các mẫu chế tạo.
- Vẽ đồ thị so sánh khả năng giải phóng DOX của 4 hệ tại môi trường pH 5,5 và 7,4.
- Dựa vào giá trị OD để tính %CS (phần trăm tế bào sống sót). Sau đó tính IC50
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Các đặc trưng hóa lý của vật liệu
3.1.1. Phổ hồng ngoại
Hình 5: Phổ IR của DOX, AD, ADFo, acid folic và alginat
Theo hình 5, phổ FTIR của hai mẫu AD và ADFo có sự thay đổi rõ ràng so với phổ FTIR của alginat, doxorubicin và acid folic. Đỉnh tại 1032 cm-1 trên phổ của ADFo và đỉnh 1034 trên phổ của AD được cho là của nhóm C-O (1020 cm-1) trong phân tử alginat. Bước sóng được coi là đặc trưng của DOX là 1630 và 1084 cm-1 lần
lượt dịch chuyển thành bước sóng 1635 và 1075 cm-1 ở trên phổ cả 2 mẫu AD,
ADFo. Hai phân tích trên chứng tỏ: trong mẫu AD, ADFo có sự xuất hiện của phân tử doxorubicin gắn với alginat. Ngoài ra, trên phổ của mẫu ADFo có thêm đỉnh
1695 cm-1 là đỉnh đặc trưng của acid folic (1693 cm-1). Điều
Hình 6: Đồ thị so sánh phổ IR của FAD, FADFo và Fe3O4
Quan sát tiếp phổ của FAD và FADF, ngoài các đỉnh giống với phổ của AD,
ADFo, còn thấy xuất hiện đỉnh 586 cm-1, là đỉnh đặc trưng cho liên kết Fe – O (605
cm-1) trong phân tử Fe3O4. Phân tích này chứng tỏ có sự xuất hiện của Fe3O4 trong
hai mẫu FAD và FADF.
Kết luận: Đã chế tạo thành công 4 hệ phân phối thuốc, có các thành phần như sau:
AD: aginate – doxorubin.
ADFo: alginat – doxorubicin – acid folic.
FAD: Fe3O4 - alginat – doxorubicin.
FADF: Fe3O4 - alginat – doxorubicin - acid folic.
Hình 7: Ảnh FESEM vật liệu FA
Hình ảnh FESEM của FA ( Fe3O4 bọc Aginate) cho thấy các hệ tạo thành là
các hạt nano oxid sắt từ có kích thước trung bình từ 30 - 40 nm, phù hợp để ứng dụng trong việc chế tạo các hệ phân phối thuốc cấu trúc nano.
(a)
(c)
(d)
Hình 8: Ảnh FESEM các vật liệu: (a) AD (b) ADFo
Kết quả thu được từ ảnh FESEM trên hình 8 cho thấy, các mẫu AD, ADFo, FAD và FADF ở dạng rắn có dạng hình cầu và độ phân bố tương đối đồng đều, kích thước các hạt từ 80 – 100 nm.
3.1.3. Độ bền và kích thước hạt trong môi trường lỏng
Hình 9: Sự phân bố kích thước tiểu phân trong chất lỏng mẫu FA
Hình 11: Sự phân bố kích thước tiểu phân trong chất lỏng mẫu ADFo
Hình 12: Sự phân bố kích thước tiểu phân trong chất lỏng mẫu FAD
Bảng 1: Kích thước trung bình hạt và thế Zeta khi phân bố trong chất lỏng
Từ bảng 1 cho thấy mẫu FA có kích thước hạt nhỏ, độ bền, độ ổn định cao, thích hợp để ứng dụng làm hệ phân phối thuốc nano.
Trong 4 hệ dẫn tạo thành, hệ AD có kích thước hạt lớn nhất (331 nm), chỉ số PDI khá cao (0,425) cho thấy các hạt trong mẫu có kích thước không đồng đều. Hệ có thế Zeta thấp (-12,7 mV), điều này chứng tỏ rằng, khi phân tán trong nước, mẫu AD kém ổn định và kém bền.
Mẫu FADF và FAD có kích thước các hạt nhỏ (218 nm và 279 nm), chỉ số PDI thấp (0,114 và 0,185) cho thấy hệ tạo thành có kích thước các hạt khá đồng đều. Bên cạnh đó, hệ có thế Zeta lớn ( -34,5 và -39 mV) nên có thể khẳng định FADF và FAD là 2 hệ ổn định và bền vững, phù hợp với việc ứng dụng làm thuốc để chữa bệnh cho người.
Các mẫu có Fe3O4 là FAD, FADF có kích thước tiểu phân nhỏ và độ ổn định hơn hẳn các mẫu không có Fe3O4 là AD và ADFo. Điều này khẳng định rằng Fe3O4
có vai trò làm ổn định các hệ phân phối thuốc mà trong thành phần có doxorubicin và alginat.
Nhìn vào 2 bảng số liệu trên ta thấy, kích thước hạt của các mẫu được đo trên
phổ tán xạ laze động có kích thước lớn hơn so với ảnh chụp FESEM. Điều này có thể được giải thích như sau: khi các hạt thuốc được bọc bằng các polyme và phân tán trong môi trường nước, các polyme ưa nước sẽ tương tác với nước và làm cho các hạt có kích thước lớn hơn. Kích thước hạt của các mẫu sau khi bọc được chụp bằng ảnh FESEM thường nhỏ hơn so với kích thước hạt chụp bằng phương pháp tán xạ laze động cũng được các nhóm tác giả công bố trong thời gian qua [7],[ 9].
Ở cả trạng thái rắn và trạng thái lỏng khi phân tán trong dung dịch, bốn hệ có kích thước dao động từ 80 – 331 nm, nằm trong vùng kích thước nano đúng như mục tiêu thứ nhất của đề tài.
3.1.4. Khả năng đốt nhiệt cảm ứng55 55 FAD 1 mg/ml 50 FAD 2 mg/ml FAD 3 mg/ml N hi et d o Thoi gian N h ie t d o (o C ) Thoi gian (s) Hình 14: Khả năng đốt nhiệt của FAD Hình 15: Khả năng đốt nhiệt của FADF 5 5 FAD 2mg/ml 5 0 4 5 4 0 3 5 3 0 2 5 T h o i g i a n ( s )
Quan sát 3 hình 14,15,16 cho thấy 2 vật liệu FAD và FADF đều có khả năng tạo nhiệt cảm ứng tỉ lệ thuận theo nhiệt độ và thời gian. Tuy nhiên, vật liệu FADF có khả năng tạo nhiệt cảm ứng tốt hơn vật liệu FAD.
Kết luận: FAD và FADF là hai hệ đa chức năng, kết hợp cả hóa trị liệu
(doxorubicin) và nhiệt trị liệu (Fe3O4) trong một hệ phân phối thuốc điều trị ung thư.
3.2. Hiệu suất mang thuốc, khả năng giải phóng của các hệ trong môi trườngpH 5,5 và 7,4; tác dụng in vitro của các hệ trên tế bào thường Vero và 3 dòng tế pH 5,5 và 7,4; tác dụng in vitro của các hệ trên tế bào thường Vero và 3 dòng tế bào ung thư Hep – G2, Hela, LU – 1.
3.2.1 Hiệu suất mang doxorubicin của các hệ dẫn
Bảng 2: Hiệu suất mang thuốc của 4 hệ
Hiệu suất mang doxorubicin của 4 hệ dẫn tạo thành là khá cao. Hệ AD có hiệu suất mang thuốc thấp nhất và hệ ADFo có hiệu suất mang thuốc cao nhất. Kết quả này có thể được lí giải do trong hệ AD chỉ hình thành liên kết amid gắn 2 phân tử DOX và alginat lại với nhau, nên hiệu suất không cao bằng hệ ADFo có thêm acid folic tạo thêm cầu nối gắn kết với các phân tử DOX. Ngoài ra, với sự có mặt
của các phân tử Fe3O4 cũng làm tăng hiệu suất mang thuốc hơn so với hệ AD chỉ có
alginat và doxorubicin.
3.2.2. Khả năng giải phóng của các hệ dẫn ở môi trường pH 5,5 và 7,4
Bảng 3: % giải phóng DOX ở môi trường pH 5,5
Thời gian (h) 0 6 8 12 18 24 36
Bảng 4: % giải phóng DOX ở môi trường pH 7,4: Thời gian (h) 0 6 8 12 18 24 36 48
%
G
P
Thoi gian (h)
Hình 17: Đồ thị % giải phóng DOX 4 hệ tại pH 7,4
40 35 30 % G P 25 20 15 10 5 0 Thoi gian
G P ( % ) %
Thoi gian (Gio)
Hình 19: Đồ thị so sánh % giải phóng DOX của AD, ADFo tại pH 7, 4 và 5,5
(%
)
%
G
P
Thoi gian (Gio)
Hình 20: Đồ thị so sánh % giải phóng DOX của FAD và FADF tại pH 7,4 và 5,5
các mẫu dao động từ 17,8 – 40,2 %. Như vậy khả năng giải phóng chậm, từ từ và liên tục của các hệ dẫn thuốc giống như việc chia nhỏ liều doxorubicin hoặc truyền kéo dài, giúp làm giảm tác dụng không mong muốn của thuốc.
Mô hình giải phóng thuốc của các hệ ở hai môi trường pH là giống nhau: giải phóng nhanh, tăng dần trong vòng 8 giờ đầu, sau đó tốc độ giải phóng thuốc chậm dần. Hệ dẫn thuốc AD có khả năng giải phóng thuốc nhanh nhất, sau đó đến FAD, FADF và giải phóng chậm nhất là hệ dẫn ADFo.
Tại môi trường pH của tế bào ung thư – pH 5,5, tốc độ giải phóng doxorubicin của các hệ nhanh hơn hẳn so với môi trường pH sinh lý – 7,4. Kết quả
này cũng được chỉ ra trong nghiên cứu “pH-sensitive polymeric micelles formed by
doxorubicin conjugatedprodrugs for co-delivery of doxorubicin and paclitaxel” của
các tác giảYakun Ma, Xiaohui Fan và Lingbing Li [2]. Có thể lý giải kết quả này do
alginat gắn với DOX thông qua liên kết amid NHCO. Ở môi trường pH 5,5, quá trình thủy phân amid thành alginat và DOX diễn ra nhanh hơn so với môi trường pH 7,4. Do đó, lượng doxorubicin giải phóng ra ở môi trường pH 5,5 lớn hơn ở môi trường pH 7,4. Kết quả này là đúng với mục tiêu chế tạo các hệ dẫn thuốc hướng đích, sẽ giải phóng thuốc nhanh ở môi trường tế bào ung thư, và giải phóng chậm ở môi trường tế bào lành.
3.2.3. Tác dụng in vitro trên dòng tế bào thường Vero và 3 dòng tế bào ung thư Hep – G2, Hela, LU – 1. Hep – G2, Hela, LU – 1.
Bảng 5: Giá trị IC50 của các hệ
Dòng TB Mẫu
Nhận xét:
Các mẫu AD và ADFo biểu hiện hoạt tính gây độc cho 3 dòng tế bào ung thư
(Hep-G2, HeLa, LU-1), và gây độc cho dòng tế bào thường (Vero).
Các mẫu FAD, FADF biểu hiện hoạt tính gây độc 2 dòng tế bào ung thư
(Hep-G2, HeLa), không gây độc cho dòng tế bào LU-1 và tế vào thường (Vero). Bốn hệ tạo thành đều có hiệu quả gây độc đối với 2 dòng tế bào ung thư Hep – G2 và Hela. Bên cạnh đó, chúng tôi thấy rằng acid folic đóng vai trò quan trọng
trong việc làm giảm giá trị IC50 của các mẫu khi có mặt acid này. Các mẫu chứa
acid folic ( ADFo, FADF), có giá trị IC50 giảm từ 1,15 – 2,8 lần so với các mẫu không có (AD, FAD). Điều này phù hợp với lí thuyết cho rằng acid folic giúp làm tăng khả năng hướng đích, gây độc tế bào ung thư.
Trong thí nghiệm này, với sự có mặt của DOX, alginat đã không làm thay đổi đặc tính hướng đích này của acid folic.
Khi thử nghiệm trên dòng tế bào thường Vero, chúng tôi thấy rằng IC50 của các hệ bào chế AD, ADFo lớn hơn so với doxorubicin tự do. Như vậy, hệ AD, ADFo có độc tính thấp hơn so với doxorubicin ở dạng tự do. Và đặc biệt, hệ FAD, FADF không gây độc đối với dòng tế bào này. Hai phân tích trên chứng tỏ được tính an toàn của các hệ đối với dòng tế bào thường Vero.
Kết luận: Bốn hệ tạo thành cho thấy đặc tính hướng đích hiệu quả: an toàn hơn với các tế bào thường, nhưng vẫn có tác dụng gây độc đối với các dòng tế bào ung thư.
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu chi tiết và các thảo luận thích hợp, một số kết luận chính được rút ra như sau:
1. Đã chế tạo thành công 4 hệ nano doxorubicin đa chức năng: AD, ADFo, FAD,
FADF.
2. Đánh giá được hiệu suất mang thuốc và khả năng giải phóng thuốc của các
hệ tại pH 5,5 và 7,4. Bên cạnh đó, đánh giá được tác dụng in vitro của bốn hệ
tạo thành: có tính hướng đích hiệu quả, an toàn hơn trên các tế bào thường, nhưng vẫn có tác dụng gây độc đối với các dòng tế bào ung thư.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Z. Ahmad và các cộng sự (2006), "alginate nanoparticles as antituberculosis
drug carriers: formulation development, pharmacokinetics and therapeutic
potential", Indian J Chest Dis Allied Sci. 48(3), tr. 171-6.
2. Y. Ma, X. Fan và L. Li (2016), "pH-sensitive polymeric micelles formed by
doxorubicin conjugated prodrugs for co-delivery of doxorubicin and
paclitaxel", Carbohydr Polym. 137, tr. 19-29.
3. L. H. Reddy và các cộng sự (2012), "Magnetic nanoparticles: design and
characterization, toxicity and biocompatibility, pharmaceutical and
biomedical applications", Chem Rev. 112(11), tr. 5818-78.
4. S. Teletchea và các cộng sự (2014), "Novel RANK antagonists for the
treatment of bone-resorptive disease: theoretical predictions and
experimental validation", J Bone Miner Res. 29(6), tr. 1466-77.
5. J. Xu và các cộng sự (2016), "Characterization and evaluation of a folic acid
receptor-targeted cyclodextrin complex as an anticancer drug delivery
system", Eur J Pharm Sci. 83, tr. 132-42.
6. Phạm Thị Ngọc Bích (2014), Nghiên cứu tổng hợp Canxi Hydroxy Apatit
trên nền alginat tách từ rong biển Nha Trang (Việt Nam, Luận văn thạc sĩ
khoahọc, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
7. Rute F. Domingos và các cộng sự (2009), "Characterizing Manufactured
Nanoparticles in the Environment: Multimethod Determination of Particle
Sizes", Environmental Science & Technology. 43(19), tr. 7277-7284.
8. Dược thư Quốc gia Việt Nam (2009), Bộ Y tế, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
9. Mikhail Y. Berezin Guorong Sun, Jinda Fan, Hyeran Lee, Jun Ma, Ke Zhang,
Karen L. Wooley và and Samuel Achilefu (2010), "Bright fluorescent nanoparticles for developing potential optical imaging
contrast agents", Nanoscale, tr. 548 - 558.
10. Nguyễn Hoàng Hải (2009), "Ứng dụng nano từ tính oxit sắt",
12. Greg T. Hermanson (2013), Chapter 4 - Zero-Length Crosslinkers,
Bioconjugate Techniques (Third edition), Academic Press, Boston, 259-273.
13. a Teresinha G. da Silva Iane B. Vasconcelos, b Gardenia C. G. Milita˜o,c
Thereza A. Soares,d Nailton M. Rodrigues,e Marcelo O. Rodrigues,df Nivan B. da Costa Jr.,e Ricardo O. Freiree and Severino A. Junior (2012), "Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF- 8", RSC Advance(2), tr. 9437 - 9442.
14. Lưu Mạnh Kiên (2008), Hạt nano từ tính Fe3O4: tính chất và ứng dụng để
đánh dấu tế bào và xử lí nước bị nhiễm bẩn, Khóa luận tốt nghiệp đại học,
Đạihọc công nghệ - Đại học quốc gia Hà Nội.
15. TS. Trần Đức Hậu PGS (2007), Hóadược tập2, Nhà xuất bản Y học, Bộ Y tế.
16. Cristina de Castro Spadari, Luciana B. Lopes và Kelly Ishida (2017),