3.2.1. Hợp chất X1
Tính chất: kết tinh hình phiến, không màu [α]D25 = - 187,0 (c=0,15; CHCl3).
Nhiệt độ nóng chảy Mp =238-239oC
Rf = 0,51 (TLC silica gel, n-hexan/ EtOAc, 7:3, v/v)
ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 277 [M+H]+ ứng với công thức phân tử (C16H20O4), M= 276
Hình 3.3. Cấu trúc của hợp chất X1
Phổ 1H-NMR (CDCl3,500MHz), 13C-NMR (CDCl3,125MHz) của chất X1
được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR và DEPT của hợp chất X1 và chất tham khảo
Vị trí C
1 2
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16- OMe OH-9 Ghi chú:
(CDCl3,125MHz) của chất tham khảo [15]
Đơn vị : δH và δ C là ppm; J là hằng số tương tác spin- spin giữa các proton và có đơn vị là Hz.
Biện luận công thức cấu tạo:
Chất X1 kết tinh hình phiến, không màu, nhiệt độ nóng chảy: 238-239
oC, Rf=0,5 (n-hexan/ethyl acetat: 7/3, v/v); Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z=277 [M+H]+ , tương ứng với khối lượng phân tử là 276. Các dữ liệu phổ khối và phổ 13C-NMR cho biết chất X1 có công thức phân tử là C16H20O4 (DBE=7)
Phân tích các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của X1 cho thấy chất X1 có khung tương đồng với chất Chloranthalacton B bao gồm một nhóm α, β-ethylen-γ-lacton ở ở δ C 156,3; 128,0 và 171,0 ppm. Một vòng cyclopropan gồm 1 nhóm methylen cho tín hiệu ở δH 0,67 (1H, dt, J = 3,9;
5,3 Hz), 0,82 (1H, dt, J = 5,3, 8,7 Hz); δC 15,7 (C-2) và 2 nhóm methin ở δH
2,11 (1H, br, dt, J = 3,9; 8,7 Hz ); δC 22,8 (C-1) và δH 1,96 (1H, m); δC 23,6 (C-3). Tín hiệu của nhóm >C=CH2 cũng được quan sát thấy trên phổ 1H- NMR, 1 3C-NMR ở δC 152,2; 106,0 và δH 4,70 (1H, br, t); 5,01 (1H, m, OH).
Tuy nhiên có 2 điểm khác biệt đó là thay vì nhóm oxiran trong Chloranthalacton B thì trong X1 xuất hiện một nhóm -CH-OH và 1 nhóm methoxy thể hiện trên phổ 13C-NMR và 1H- NMR ở δC 79,6 (C-9), δH 3,83 (1H, d, J =7,4 Hz, H-9), 3,41 (1H, d, J = 7,4 Hz, OH). δC 50,3 (OCH3) và δH 3,22 (3H, s, OCH3).
Phân tích các dữ liệu trên phổ 1H- NMR, 13C-NMR và các phổ 2D-NMR của chất X1 kết hợp so sánh các dữ liệu phổ trong tài liệu [15], khẳng định chất X1 chính là 9-hydroxyheterogorgiolid.
3.2.2. Hợp chất X2
Tinh thể màu vàng, tan trong cloroform Nhiệt độ nóng chảy tnc = 178-180oC
Phổ khối lượng HR-ESI-MS (+) m/z: 252,08 [M+H]+, ứng với CTPT C15H10N2O2, M= 251
Phổ 1H-NMR (CDCl3,500MHz), 13C-NMR (CDCl3,125MHz) của chất X2 được trình bày ở bảng 3.2 Vị trí C 1 2 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR và DEPT của hợp chất X2 và chất tham khảo Q [16, 28]
Biện luận công thức cấu tạo:
Hợp chất X2 dạng tinh thể màu vàng, tan trong cloroform, nhiệt độ nóng chảy 178-180 0C và cho phản ứng với thuốc thử Dragendorff. Trên phổ HR-ESI- MS của X2 xuất hiện peak ion giả phân tử tại m/z 252,08 [M+H]+
ứng với khối lượng phân tử là 251 và kết hợp với phổ 1 3 C-NMR cho phép khẳng định công thức phân tử của X2 là C15H10N2O2
Phổ 1 H-NMR của X2 cho tín hiệu doublet đặc trưng của proton H-4 tại δ 7,98 và H-5 tại δ 6,93 với hằng số tương tác J = 9,5 Hz; một cặp proton vicinal H-1 tại δ 7,80 và H-2 tại δ 8,74 với J = 5,0 Hz. Ngoài ra, còn xuất hiện tín hiệu của một nhân thơm ABX với ba proton tại δ 8,16 (1H, d, J = 2,0 Hz,
H-8), 7,04 (1H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz, H-10), 7,90 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11). Sự hiện diện của nhóm methoxy được chỉ ra tại δ 56,0 (C-17) và
δ 3,98 (3H, s, H-17). Nhóm này gắn với C-9 dựa vào tương tác H-17/C-9 trong phổ HMBC. Kết hợp các dữ liệu phổ của X2 và đồng thời so sánh với tư liệu [16, 28], khẳng định X2 là 9-methoxycanthin-6-on, một alkaloid.
3.2.3. Hợp chất X3 Chất bột màu trắng, vô định hình [α]D25 = -80,5(c=0,1, MeOH) Phổ ESI-MS: m/z 263,2 [M+H]+ Công thức phân tử: C16H22O3. M= 262 Hình 3.5. Cấu trúc của hợp chất X3 Phổ 1H-NMR (CDCl3,500MHz), 13C-NMR (CDCl3,125MHz) của chất X3 Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ(ppm): 169,7(C-2); 117,2(C-3);
173,0(C-3a); 38,7(C-4); 47,7(C-4a); 18,4(C-5); 30,9(C-6); 134,2(C-7); 123,5(C-8); 30,1(C-8a); 40,2(C-9); 107,5(C-9a); 25,7(C-10); 25,2(C-11); 23,1(C-12); 50,3(9a-OMe). Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ(ppm): 5,81(1H, s, H-3); 1,68(1H, m, H-4a); 1,16 (1H, m, H-5α)/1,68 (1H, m, H=5β); 1,97(1H, m, H-6); 5,36(1H, d, J=5.0Hz, H-8); 2,77(1H, m, H-8a); 1,52 (1H, dd, J=13.5, 13.5Hz, H-9α)/2,34 (1H, dd, J=3.5, 13.5Hz, H-9β); 1,37(1H, s, H-10); 1,24(1H, s, H-11); 1,62(1H, s, H-12); 3,17(1H, s, OMe).
Hợp chất X3 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ khối lượng ESI-MS của X3 xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 263,2 [M+H]+, phù hợp với công thức phân tử C16H22O3, (M = 262) .
Phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu c ủa 2 proton olefin tại δH 5,36 (d,
J=5,0 Hz) và 5,81 (s); 1 methoxy tại δH 3,17 (s); và 3 methyl tại δH 1,24 (s), 1,37 (s) và 1,62 (s). 1 nhóm carbonyl tại δC 169,5; 4 carbon bậc 4 tại δC 38,7, 107,5, 134,2 và 173,0; 4 methin tại δC 30,1, 47,7, 117,2 và 123,5; 3 methylen tại δC 18,4, 30,9 và 40,2; và 4 methyl tại δC 23,1; 25,2; 25,7 và 50,3.
Từ dữ liệu phổ 1D-NMR của X3 dẫn đến gợi ý về cấu trúc của X3 tương tự hợp chất O-methyl furodysinin lacton [13]. Phân tích các tương tác trên phổ HSQC cho phép ta gán tín hiệu của proton liên kết trực tiếp với carbon. Phổ HMBC, thấy xuất hi ện tương tác giữa H-10 (δH 1,37)/H-11 (δH 1,24) với C-3a (δC 173,0)/C-4 (δC 38,7)/C-4a (δC 47,7), H-3 (δH 5,81) và C-2 (δC
169,5)/C-3a (δC 173,0)/C-9a (δC 107,5) đã xác định vị trí 2 nhóm methyl gắn trực tiếp vào C-4, vị trí nối đôi tại C-3/C-3a. Tương tác HMBC của nhóm methoxy δ H 3,17 và C-9a (δC 107,5) xác định vị trí methoxy tại C-9a. Tương tác HMBC của H-12 (δH 1,62) với C-6 (δC 30,9)/C-7(δC134,2)/C-8 (δC 123,5) , H-8 (δH 5,36) với C-4a (δC 47,7)/C-8a (δC 30,1) xác định vị trí nối đôi tại C- 7/C-8. Dựa vào dữ liệu phổ 1D, 2D-NMR của X3 và so sánh với số liệu của hợp chất O-methyl furodysinin lacton [13] thấy trùng khớp. Từ các dữ liệu phổ, cấu trúc của X3 được xác định là O-methyl furodysinin lacton.
Bàn luận
Việc chiết xuất và phân lập:
Phương pháp chiết xuất bằng EtOH và phân lập các chất bằ ng sắc ký cột được tham khảo từ các nghiên cứu trước đó. Đề tài đã chiết xuất cao toàn phần từ lá cây Khôi đốm bằng phương pháp ngâm tại nhiệt độ phòng với dung môi cồn 80%. Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền thu được khối lượng cắn toàn phần đạt 6% so với lượng dược liệu ban đầu. Cắn toàn phần sau đó được chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là nhexan, ethyl acetat và chạy qua cột sắc ký Diaion, thu được lần lượt các cắn phân đoạn với khối lượng đạt 0,368% ; 1,152% ; 1,064% so với nguyên liệu khô ban đầu.
Kết quả phân lập được 3 thành ph ần từ phần lá của cây lá Khôi đốm thu tại tỉnh Nam Định. Cấu trúc các hợp chất này được xác định thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối, phổ cộng hưởng hạt nhân và so sánh với các dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan. Ba hợp chất được xác định là 9-methoxycanthin-6-on (X1), 9-hydroxyheterogorgiolid (X2), O-methyl furodysinin lacton (X3).
Các hợp chất trên cũng đã được tách và nghiên cứu từ cây khác, hợp chất (1) có tác dụng kháng viêm. Hợp chất (X2), ( X3) gây độc tế bào ung thư [15, 16, 28].Tuy nhiên đây là lần đầu tiên 3 hợp chất này được phân lập từ cây Khôi đốm. Việc chiết xu ất tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lí của 9-methoxycanthin-6-on (X1), 9-hydroxyheterogorgiolid (X2), O- methyl furodysinin lacton (X3).
Tuy nhiên, trong quá trình phân lập hiện chưa phát hiện thêm các thành phần điển hình khác được nhắc đến trong các nghiên cứu trước đó như các hợp chất : flavononid, alkaloid,... Điều này có thể được lý giải là do thời điểm thu hái không phù hợp, điều kiện môi trường sống nhiều khắc nghiệt, hay do quá trình di thực nên làm cho hàm lượng hợp chất trong mẫu Khôi đốm được nghiên cứu chỉ chiếm tỉ lệ thấp; hoặc do hệ dung môi lựa chọn không phải là thích hợp nhất để phân lập ra các hợp chất.
Các nghiên cứu của đề tài chỉ mới là bước đầu, tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn về Khôi đốm; bổ sung tư liệu cho việc sử dụng cây làm thuốc trong dân gian, cũng như phục vụ cho lĩnh vực kiểm nghiệm dược liệu sau này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau :
+ Chiết xuất, phân lập: Đã sử dụng phương pháp chiết ngâm với dung môi EtOH 80% và bằng phương pháp sắc ký cột để chiết xuất phân lập được 3 hợp chất từ lá của cây Khôi đốm
+ Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được: Thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ tử ngoại- khả kiến, phổ khối, và phổ cộng hưởng hạt nhân, đã xác định được c ấu trúc của 3 hợp chất 9- methoxycanthin-6-on (X1), 9-hydroxyheterogorgiolid (X2), O-methyl furodysinin lacton (X3). Đây là lần đầu tiên 3 hợp chất này được phân lập từ lá cây Khôi đốm.
Kiến nghị
+ Tiếp tục triển khai phân lập các hợp chất khác từ loài Sanchezia
nobilis Hook.f.
+ Dựa trên kết quả đã nghiên cứu về thành phần hóa học, cần nghiên cứu tác dụng sinh học của loài này về tác dụng chống viêm giảm đau, chống loét dạ dày và các tác d ụng sinh học khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Bộ môn Dược liệu Đại học Dược Hà Nội (2009), Thực tập dược liệu, pp. 54-69.
2. Bộ Y tế (2008), Y học cổ truyền, Nxb. Y học, Hà Nội, pp. 198. 3. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học I, Nxb. Y học, Hà Nội, pp. 255-256. 4. Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2006), Dược học cổ truyền, Nxb. Y
học, Hà Nội, pp. 231-232.
5. Nguyễn Tiến Bân, V. P. Serov (2005), Danh mục các loài thực vật Việt
Nam, tập III, Hà Nội, Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr.272-273.
6. Nguyễn Thị Mai (2017), “ Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây Xăng sê”, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. 7. Phan Văn Chiêu (2011), Đông nam dược nghiệm phương, Nhà xuất bản
Thuận Hóa, tr.856.
8. Nguyễn Trung Hòa (2012), Đông y toàn tập, Nhà xuất bản Thuận Hóa, tr.1234-1235.
9. Phạm Hoàng Hộ (2000), ây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, quyển 3, tr. 39.
Tài liệu Tiếng Anh
10. Abd-Ellah A., Mohamed K., Backheet E., et al. (2014), "Cinnamyl Alcohol, Benzyl Alcohol, and Flavonoid Glycosides from Sanchezia
nobilis", Chemistry of Natural Compounds, 50(5), pp.715-717.
11. Adams C (1972), Flowering plants of Jamaica, Mona, Jamaica: University of the West Indies, pp 785-788.
12. Ahmed E. Abd-Ellah, Khaled M. Mohamed, Enaam Y. Backheet and Mahmoud H. Mohamed (2006), „„Macro-and micromorphology of
Sanchezia nobilis Hook. cultivated in Egypt: leaf, stem and flower‟‟, Bull. Pharm. Sci., Assiut University, Vol. 29, Part 2, pp. 300-327.
13. Andrew M. Piggott and Peter Karuso (2005), “ 9-Hydroxyfurodysinin-O-ethyl Lactone: A New SesquiterpeneIsolated from the Tropical Marine Sponge ”, Dysidea arenaria,Molecules, 10, pp.1295-1297.
Matsutake alcohol glycosides from Sanchezia nobilis ", Chemistry of
Natural Compounds, 48(6), pp. 930-933.
15. Kevin Hung, Xirui Hu and Thomas J. Maimone (2005), “ Total synthesis of complex terpenoids employing radical cascade processes”, Nat. Prod.
Rep., 22, 465.
16. Kensuke Ohishi, Kazufumi Toume, Midori A. Arai, Takashi Koyano, Thaworn Kowithayakorn, Takamasa Mizoguchi, Motoyuki Itoh, and Massami Ishibashi (2015),“9-Hydroxycanthin-6-one,a β-Carboline Alkaloid from Eurycoma longifolia, Is the First Wnt Signal Inhibitor through Activation of Glycogen Synthase Kinase 3β without Depending on Casein Kinase 1α”. J. Nat. Prod., 78 (5), pp 1139–1146
17. Leonard E. C. and Smith L. B. (1964), "Sanchezia and related American Acanthaceae", Rhodora, 66(768), pp. 313-343.
18. Lee E. H., Song D.-G., Lee J. Y., et al. (2009), "Flavonoids from the leaves of Thuja orientalis inhibit the aldose reductase and the formation of advanced glycation endproducts", Journal of the Korean Society for
Applied Biological Chemistry, 52(5), pp. 448-455.
19. Loi Vu Duc, Tung Bui Thanh, Ha Vu Hoang and Tuyen Nguyen Manh (2016),“Phytochemical and anti-inflammatory effect from the leaf of Sanchezia speciosa Leonard growing in Vietnam”, Journal of Chemical
and Pharmaceutical Research, 8(7), pp. 309-315.
20. Ming-Xin Ren, Xiao-Hui ,Deng Fang Ai ,Guo-Yan Yuan, Hai-Yan Song (2015) “Effect of quercetin on the proliferation of the human ovarian cancer cell line SKOV-3 in vitro”, Experimental and therapeutic
medicine, 10(2), pp.579-583.
21. Nusrat Shaheeen, Muhammaduzair, Bashir Ahmad Ch and Alamgeer (2017), “ Invitro Cytotoxicity Of Sanchezia Speciosa Extracts On Human Epithelial Cervical Cancer(Hela) Cell Line”, Acta Poloniae
Pharmaceutica Drug Research, Vol. 74 No. 5, pp1389-1394.
and anti-cancer activity of methanolic extract from Sanchezia speciosa leaves", Pakistan Journal of Biological Sciences, 16(20), p. 1212-1215. 23. Parvin S., Rafshanjani M. A. S., Kader M. A., et al. (2015), "Preliminary
phytochemical screening and cytotoxic potentials from leaves of
Sanchezia speciosa Hook. f", International Journal of Advances in Scientific Research, 1(3), pp. 145-150.
24. Pereira C., Júnior B., Bomfim C., et al. (2012), "Flavonoids and a neolignan glucoside from Guarea macrophylla (Meliaceae)", Química
Nova, 35(6), pp. 1123-1126.
25. Rafshanjani M., Parvin S., Kader M., et al. (2014), "In vitro antibacterial, antifungal and insecticidal activities of ethanolic extract and its fractionates of Sanchezia speciosa Hook. f", Int Res J Pharm2014, 5(9), ap. 717-720.
26. Sciences W. A. o. and Sciences. W. A. o. (1922), Journal of the
Washington Academy of Sciences, Washington Academy of Sciences,
86(3), pp 6-3169.
27. Sciences W. A. o. and Sciences. W. A. o. (1926), Journal of the
Washington Academy of Sciences, Washington Academy of Sciences,
86(3), pp 9-2258.
28. Sofa Fajriah, Muhammad Hanafl, Atiek Sumiati, and Ngadiman (2010), “isolation and identification of 9-methoxycanthin-6-on from Eurycoma
longifolia roots”, Fitoterapia, 81(7), pp.669-679.
29. Takhtadzhian A. L. (1997), Diversity and classification of flowering
plants , Columbia University Press, New York, USA, pp 355-356.
30. Tripp E. A. and Koenemann D. M. (2015), "Nomenclatural Synopsis of
Sanchezia (Acanthaceae), Fifty Years Since Last Treated", Novon, 24(2),
ap. 213-221.
31. Tung Bui Thanh, Loi Vu Duc, Hai Nguyen Thanh , Vung Nguyen Tien. (2016) “In vitro antioxidant and anti-inflammatory activities of isolated compounds of ethanol extract from Sanchezia speciosa Leonard‟s
leaves”, J basic clin physiol pharmacol, 28(1), pp. 79-84. Website 32. https://dongybonphuong.com/ly-cay-xang-se-chua-dau-da-day/ 33. http://www.stuartxchange.org/Sanchezia 34. http://thaoduocmaxgreen.net/bai-thuoc-hay/cay-xang-se-chua-dau-da- day.html 35. https://www.gardenguides.com/101997-wintergreen-plant- information.html