Dựa trên các tiêu chí trong Dược điển Việt Nam 4 về tiêu chuẩn dược liệu:
• Mô tả
• Vi phẫu
• Soi bột
• Mất khối lượng do làm khô
• Tro toàn phần • Tỷ lệ vụn nát • Định tính • Định lượng • Kim loại nặng 2.2.1.1. Mô tả
Dựa vào cảm quan. Kiểm tra hình thái, mầu sắc, mùi vị, kích thước bằng cách đo trực tiếp. Mẫu dược liệu phải đạt tiêu chuẩn đã yêu cầu.
2.2.1.2. Vi phẫu
Cắt, tẩy, nhuộm và lên tiêu bản của lá và thân cây Lá diễn, tiến hành soi trên kính hiển vi.
2.2.1.3. Bột : Làm tiêu bản , soi bột dưới kính hiển vi.2.2.1.4. Mất khối lượng do làm khô 2.2.1.4. Mất khối lượng do làm khô
Dược liệu phải được làm thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm; lượng đem thử từ 2 g đến 5 g; chiều dày lớp mẫu thử đem sấy là 5 mm và không quá 10 mm đối với dược liệu có cấu tạo xốp. Nhiệt độ và thời gian sấy theo yêu cầu của chuyên luận riêng (PL9.6 DĐVN IV).
2.2.1.5. Tro toàn phần
Cho 2 - 3 g bột đem thử vào một chén sứ hoặc chén platin đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450 oC tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hoá, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thuỷ tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Hợp dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450 oC đến khi khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí (PL 9.8 DĐVN IV).
2.2.1.6. Kim loại nặng
Lấy 1,0 g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp 3 (Phụ lục 9.4.8, DĐVN IV).Dùng 1,0 ml dung dịch mẫu 10 ppm (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu.
2.2.1.7. Tỷ lệ vụn nát
Cân một lượng dược liệu nhất định (p gam) đã được loại tạp chất. Rây qua rây có số quy định theo chuyên luận riêng. Cân toàn bộ phần đã lọt qua
rây (a gam). Tính tỷ lệ vụn nát (X%) (từ kết quả trung bình của ba lần thực hiện) theo công thức:
X %
2.2.1.8. Định tính
Phản ứng hóa học đặc trưng
Chiết xuất: Các thành phần trong dược liệu (cành lá đã phơi sấy khô) được tách ra từ các phân đoạn nhờ các dung môi có độ phân cực khác nhau như ether, cồn, nước… để có được dịch chiết phù hượp cho từng phản ứng hóa học đặc trưng trước khi tiến hành định tính.
Định tính Flavonoid:
Có nhiều phương pháp để phát hiện flavonoid chẳng hạn như:
a. Nhận biết bằng hơi amoniac:
Dịch chiết lá diễn chấm lên giấy lọc sau đó cho vào lọ bão hòa hơi amoniac. Vết flavonoid thường cho màu vàng.
b. Tác dụng với H2SO4 đậm đặc:
Hòa tan hượp chất chứa flavonoid vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến màu da cam và có phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, aurone cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ. Flavanon cho màu từ cam đến đỏ.
c. Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/etanol:
Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid hòa tan trong etanol, sẽ có màu từ vàng đến cam đỏ.
d. Phản ứng Cyanidin của Wilstatter:
Phản ứng khử bằng bột Mg trong HCl/etanol.
Cho vào ống nghiệm khoảng 2 ml mẫu thử; thêm vào 1 ml ancol tert- butyl hoặc ancol isoamyl; 0,5 ml HCl đậm đặc; 3-5 hạt Mg kim loại. Đun nhẹ
trong vài phút; lớp ancol ở trên sẽ xuất hiện màu. Nếu là Flavon; flavanon; flavanonol; xanthone sẽ cho màu cam; đỏ; tím.
Nếu dùng bột kẽm thay thế bột Mg, thì chỉ có flavanonol cho màu hồng nhạt hoặc không màu.
2.2.1.9. Định lượng
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV- VIS) bằng cách xây dựng đường chuẩn, sử dụng chất chuẩn là quercetin và máy quang phổ UV-VIS Cary 60.
2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao khô dược liệu từ cây Lá diễn
Dựa trên các tiêu chí tiêu chuẩn chung của cao khô dược liệu theo Dược điển Việt Nam 4:
• Tính chất
• Mất khối lượng do làm khô
• Độ mịn • Độ PH • Định tính • Định lượng • Tro toàn phần • Kim loại nặng • Độ nhiễm khuẩn
2.2.2.1. Tính chất: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã
nêu.
2.2.2.2. Mất khối lượng do làm khô
Tiến hành theo phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô ( Phụ lục 9.6, DĐVN IV) như đối với dược liệu Lá diễn.
Cao khô phân đoạn phải được làm thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm; lượng đem thử từ 2 g đến 5 g; chiều dày lớp mẫu thử đem sấy là 5
am và không quá 10 mm nếu có cấu tạo xốp. Nhiệt độ và thời gian sấy theo yêu cầu của chuyên luận riêng.
Tiến hành xác định độ mịn của bột theo phụ lục 3.5, DĐVN IV. Lấy 20g chế phẩm, không ít hơn 95% phần tử qua được rây số 355 và không quá 40% qua được rây số 180.
2.2.2.4. Độ PH: tiến hành đo độ PH bằng máy đo PH AL 20-Aqualitic.
2.2.2.5. Định tính: Đối với cao khô ta cần định tính Flavonoid là chất có
hoạt chất sinh học chính trong dược liệu Lá diễn. Phản ứng hóa học
Lấy khoảng 2g bột dược liệu, thêm 10ml ethanol 90%. Đun sôi trong 3 phút, để nguội, lọc. Lấy 2ml dịch lọc, pha loãng với 10ml ethanol 90% rồi chia vào 3 ồng nghiệm để làm các phản ứng sau:
Ống 1: Thêm 5 giọt acid hydrocloric đậm đặc (TT) và ít bột magnesi, dung dịch chuyển dần từ màu vàng nhạt sang màu tím đỏ.
Ống 2: Thêm 2 giọt dung dịch natri hydroxyl 20% (TT), xuất hiện màu vàng đậm.
Ống 3: Thêm 2 giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT), dung dịch có màu nâu tím.
2.2.2.6. Định lượng [4, 10, 17].
Flavonoid toàn phần trong Lá diễn có thể chiết xuất bằng dung môi methanol hoặc ethanol [17, 26]. Để chiết flavonoid toàn phần từ dược liệu có các phương pháp sau : phương pháp ngâm, phương pháp siêu âm, chiết soxhlet… Trong đó phương pháp chiết bằng siêu âm chiết kiệt được flavonoid toàn phần trong dược liệu, rút ngắn thời gian chiết, cách tiến hành đơn giản. Qua tham khảo tài liệu và sau khi khảo sát sơ bộ chúng tôi lựa chọn chiết flavonoid toàn phần trong Lá diễn bằng phương pháp siêu âm sử dụng dung môi MeOH [24, 28].
Dung dịch thử gốc: Cân chính xác khoảng 0.4 g cao phân đoạn (dùng phân đoạn N để nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn) vào cốc có mỏ, thêm 2.0 ml MeOH, lắc cho tan cao rồi chuyển vào bình định mức 10.0 ml, lấy MeOH tráng cốc 2 lần và thêm đến vạch được dung dịch thử gốc. Từ dung dịch trên
lấy chính xác 1ml cho vào bình định mức 50.0 ml và thêm đến vạch bằng MeOH được dung dịch thử gốc có độ hấp thụ quang A ( 0.2-0.8 Abs).
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 10.0 mg quercetin cho vào bình định mức dung tích 10.0 ml, hòa tan và thêm đến vạch bằng MeOH. Thu được dung dịch quercetin chuẩn nồng độ 1mg/ml. Từ dung dịch này pha loãng bằng MeOH thành dung dịch quercetin chuẩn gốc có nồng quercetin
100 µg/ml bằng cách lấy 10ml dung dịch chuẩn gốc trên cho vào bình định mức 100.0 ml và thêm MeOH đến vạch.
Chuẩn bị dung dịch để đo quang
Chuẩn bị dung dịch thử: Lấy 1,0ml dung dịch thử gốc cho vào bình định mức dung tích 10.0 ml. Thêm vào bình 4ml nước cất, 0.3ml NaNO2 5%; 0.5 ml dung dịch AlCl3/EtOH 5%; 2 ml NaOH 1M lắc đều. Sau khoảng 20 phút thêm nước cất vừa đủ 10ml lắc đều đem đi đo độ hấp thụ.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: pha 1 dãy dung dịch chuẩn quercetin có nồng độ biến thiên trong khoảng 5-50 µg/ml theo bảng 3.
Lắc đều. Sau khoảng 20 phút thêm nước cất vừa đủ 25ml, lắc đều, đem đi đo độ hấp thụ.
Chuẩn bị mẫu trắng: thay 1.0ml dung dịch thử bằng 1.0ml nước cất các bước còn lại tiến hành tương tự.
Tiến hành đo quang
Quét phổ hấp thụ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn. Từ kết quả phổ hấp thụ xác định bước sóng định lượng là bước sóng cực đại. Thực nghiệm cho thấy cực đại ở bước sóng 425nm, lựa chọn bước sóng định lượng là 425nm.
Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy chuẩn tại bước sóng 425nm xây dựng đường chuẩn quercetin.
Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử tại bước sóng 425nm, dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra nồng độ của flavonoid toàn phần có trong mẫu tính theo quercetin.
Cách tính kết quả
Đo độ hấp thụ của dãy chuẩn từ đó xây dựng đường chuẩn quercetin. Do độ hấp thụ của mẫu chuẩn. Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu dược liệu theo công thức sau:
Trong đó: F: là hàm lượng flavonoid toàn phần có trong dược liệu (%)
: là nồng độ flavonoid toàn phần trong dung dịch thử tính theo quercetin (Giá trị này được phần mềm trong máy quang phổ UV- VIS Cary 60 tính ra dựa vào đường chuẩn quercetin và độ hấp thụ
của mẫu thử ) (mg/ml)
h: là độ ẩm của dược liệu (Độ ẩm lá diễn xác định trên cân hàm ẩm là: 8.3 (%)
m: là khối lượng mẫu ban đầu (g) 50×10: là độ pha loãng
2.2.2.7. Tro toàn phần
Cho 2 - 3 g bột đem thử vào một chén sứ hoặc chén platin đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450 oC tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hoá, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thuỷ tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Hợp dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450 oC đến khi khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí.
2.2.2.8. Kim loại nặng (Pb)
Lấy 1.0 g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp 3 (Phụ lục 9.4.8, DĐVN IV). Dùng 1.0 ml dung dịch mẫu 10 phần triệu (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu.
Lấy một lượng chế phẩm thử như chỉ dẫn trong chuyên luận (không nhiều hơn 2 g) cho vào một chén nung silica. Thêm 4 ml dung dịch magnesi sulfat 25% trong acid sulfuric 1M (TT). Trộn đều bằng một đũa thuỷ tinh nhỏ rồi đun nóng cẩn thận. Nếu hỗn hợp là một chất lỏng thì làm bay hơi từ từ trên cách thuỷ đến khô. Đốt dần dần để than hoá, chú ý đốt ở nhiệt độ không cao quá 800oC, tiếp tục đốt cho đến khi thu được cắn màu trắng hay xám nhạt. Để nguội, làm ẩm cắn bằng khoảng 0.2 ml dung dịch acid sulfuric 1M (TT), bốc hơi rồi đốt lại, sau đó để nguội. Toàn bộ thời gian đốt không nên quá 2 giờ. Hoà tan cắn, dùng 2 lượng, mỗi lượng 5 ml dung dịch acid hydrocloric 2M (TT). Thêm 0.1 ml dung dịch phenolphtalein (TT), rồi cho từng giọt dung dịch amoniac đậm đặc (TT) đến khi có màu hồng. Để nguội, thêm acid acetic băng (TT) đến khi mất màu dung dịch, rồi thêm 0.5 ml nữa. Lọc nếu cần, rồi pha loãng dung dịch với nớc thành 20 ml.
Lấy 12 ml dung dịch thu được ở trên cho vào một ống nghiệm, thêm 2 ml dung dịch đệm acetat pH 3.5, lắc đều. Thêm 1.2 ml dung dịch
màu của ống mẫu được chuẩn bị đồng thời trong cùng điều kiện. Màu của ống thử không được đậm hơn màu của ống mẫu.
Ống mẫu được chuẩn bị như sau: Lấy một thể tích dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb như đã chỉ dẫn trong chuyên luận, cho vào chén nung silica, thêm 4 ml dung dịch magnesi sulfat 25% trong acid sulfuric1M (TT), sau đó tiếp tục xử lý nh cách xử lý mẫu ghi ở trên, bắt đầu từ câu: “Trộn đều bằng một đũa thuỷ tinh nhỏ...” đến câu: “Lọc nếu cần, rồi pha loãng dung dịch với nớc thành 20 ml”. Lấy 2 ml dung dịch thu được từ xử lý chế phẩm thử cho vào một ống nghiệm, thêm 10 ml dung dịch thu được từ xử lý dung dịch chì mẫu, 2 ml dung dịch đệm acetat pH 3.5. Lắc đều, thêm 1,2 ml dung dịch thioacetamid (TT). L¾c ngay, rồi để yên 2 phút. Dung dịch ion chì mẫu có mầu nâu sáng khi được so sánh với dung dịch được chuẩn bị trong cùng điều kiện gồm 10 ml nớc và 2 ml dung dịch chế phẩm thử.
2.2.2.9. Độ vô khuẩn: thử theo DĐVN IV phụ lục 13.7.
Thí nghiệm đượcc tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm, chú ý không được lẫn chất khử khuẩn vào mẫu thử.
Đem chế phẩm sau khi đã được hoà loãng với dung môi thích hợp lọc qua màng lọc, rồi cắt các màng lọc thành miếng nhỏ đem nhúng vào môi trường, ủ môi trường đã cấy chế phẩm hoặc cấy màng lọc trong thời gian qui định.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu từ cây Lá diễn
Từ các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Lá diễn (Dicliptera chinensis (L.) Ness) được trình bày như sau:
Bộ phận lá và thân tươi hay phơi khô, xay bột của cây Lá diễn (Dicliptera chinensis (L.) Ness).
3.1.1. Mô tả
Hình 3.1: Thân, lá, hoa cây Lá diễn
Cây thảo sống hằng năm hay vài ba năm, cao 30-80cm. Thân và cành non có 4 cạnh, có lông tơ, các mấu phình to tựa như đầu gối. Lá mọc đối. màu xanh lục, phiến lá hình trứng thuôn, dài 2-7cm, rộng 2-4cm, đầu và gốc đều nhọn, mặt dưới có lông. Cụm hoa nhỏ ở ngọn, bao xung quanh của cụm hoa có lá bắc không đều. Đài 5, đều nhau, dính vào nhau đến ½. Tràng màu tím, hồng hay trắng, ống hơi dài hơn môi, môi dưới hơi khía ba thùy nhị hai bao phấn tù Quả nang ngắn có lông tơ ở phía đầu. Hạt dẹt, hình thấu kính.
3.1.2. Vi phẫu
Phần gân lá: gân phía trên và dưới đều lồi, gân dưới lồi nhiều hơn. Biểu bì trên và dưới là một hàng tế bào, hình trứng nhỏ, xếp đều đặn liên tục, cả biểu bì trên và dưới đều mang lông che chở đa bào cấu tạo bởi 3-4 tế bào, xếp thẳng hàng có đầu lông nhọn, dài, ở phía gốc ngắn. Xếp sát biểu bì là mô dày, thường có 2-3 hàng, là những tế bào hình tròn, kích thước không đều, có thành dày phát triển nhiều ở góc. Mô mềm là những tế bào hình đa giác hay
hình tròn, thành mỏng có kích thước không đều. Gân chính có cung libe ôm lấy cung gỗ.
Phần thân: hình tròn xẻ 4 thùy, biểu bì là một lớp tế bào hình chữ nhật, bên ngoài phủ lớp cutin mỏng, có nhiều lông che chở.
8 9 7 6 5 4 3 2 1
Hình 3.2: Hình ảnh vi phẫu thân cây Lá diễn
Ghi chú: 1. biểu bì 2. Mô dày 3. Trụ bì hóa mô cứng 4. Mô mềm 5. Libe cấp một 6. Tầng sinh gỗ 7. Gỗ cấp II 8. Mô mềm ruột 9. Lông che chở
Hình 3.3: Vi phẫu phần lá của cây Lá diễn
3.1.3. Bột
Bột (thân và lá) có màu xanh lục, có mùi thơm nhẹ của lá diễn, vị đắng. Quan sát bằng kính hiển vi thấy các đặc điểm: Mảnh mô mềm mỏng, tế bào hình đa giác, mảnh mang màu đỏ, rất nhiều tế bào mô cứng hình khối, vách dày hóa gỗ nhiều, có tế bào đứng riêng lẻ và tụ tập thành đám, lông che chở đa bào, mảnh mạch, mảnh biểu bì mang lông che chở, mảnh biểu bì mang lỗ khí, lỗ khí, sượi đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng bó, thành dày, mảnh bần có tế bào hình đa giác, màu nâu đen.
Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu bột dược liệu từ cây Lá diễn Ghi chú:
1. Mảng biểu bì mang lỗ khí
2. Lông che chở đa bào
3. Mảng mạch
4. Mảng mô mềm
5. Biểu bì
6 Tế bào mô cứng
7. Biểu bì chứa lông che chở đơn bào
8. Mảnh mạch xoắn
3.1.4. Mất khối lượng do làm khô: không quá 12%.3.1.5. Tro toàn phần: không quá 10 % .