với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004
3.3.4.1 Mục đích
Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp phân tích PCR một bước so với
phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo tiêu chuẩn ISO 11290-1: 2004 trên các mẫu cá tra nhiễm Listeria monocytogenes được lấy từ công đoạn
sản xuất.
3.3.4.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3.3.4.3 Tiến hành thí nghiệm
a) Lấy mẫu nhiểm: Từ miếng cá tra file chọn nhiều vị trí khác nhau trên mẫu cá, khoảng từ bốn đến năm vị trí.
b) Tăng sinh:Cho vào bao plastic 25gam mẫu thêm vào 225ml HF. Cho vào máy dập mẫu trong 5 phút để trộn đều mẫu, ủ mẫu ở 370C trong 24h
c) Phân lập trên ALOA: Như nêu ở mục 2.2.1.3. Sau đó chọn cùng khuẩn lạc điển hình phân tích song song bằng hai phương pháp.
d) Phân tích trên PCR: Nêu ở mục 3.2
e) Phân tích trên ISO 11290 – 1:2004: Như nêu ở mục 2.2.1.3 f) Đọc kết quả: Thu thập và đọc các kết quả dương tính
Tăng sinh trong Half Fraser
Phân lập trên ALOA
Phân tích trên kỹ thuật PCR
Chạy điện di và chụp ảnh trên gel doc
. Đọc kết quả
Phân tích trên phương pháp ISO1129-1:2004-1:2004
Thử nghiệm sinh hóa
Mười mẫu thủy sản nhiễm listeria monocytogenes
Chon khuẩn lạc điển hình trên ALOA
. Đọc kết quả Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiêm 4
3.4 Phương pháp thu thập, tính toán và xử lý số liệu Tổng hợp kết quả từ thí nghiệm 1 và 2.
Tổng số kết quả cho dương tính bằng Phương pháp PCR Phương pháp xác định LD50
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.
4.1 Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ
tiêu Listeria monocytogenes trên PCR : Để xác định tính đặc hiệu của phương pháp PCR đối với Listeria monocytogenes chúng tôi sử dụng các
chủng vi sinh vật ở Bảng 3.3 để tiến hành thí nghiệm. Các chủng dược tăng sinh 8 giờ trong môi trường BHI sau đó phân lập trên ALOA ở 370C từ 24 – 48 giờ , tiếp theo là ly trích và tinh sạch DNA và tiến hành chạy PCR với mồi sử dụng là Hly F1/R1(399bp). Kết quả thu được được thể hiện ở Bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết quả thí nghiệm xác định độ đặc hiệu.
Mẫu Chủng vi sinh vật Xuất hiện/không xuất hiện vạch 399bp
A0 Mẫu đối chứng không Không xuất hiện chứa vi sinh vật
A1 Listeria monocytogenes Xuất hiện
A2 Listeria ivanovii Không xuất hiện
A3 Listeria innocua Không xuất hiện
Thí nghiệm trên được lập lại 10 lần và đều cho kết quả tương tự như Bảng 4.1. Do mồi bổ sung là Hly F1/R1 có kích thước 399bp chỉ bắt cặp với gen
Listeriolysin của Listeria monocytogenes, trải qua quá trình luân nhiệt thì loại gen đặc hiệu cho Listeria monocytogenes này được nhân bản lên hàng tỷ lần,
khi đó kết quả trên gel doc chỉ xuất hiện vạch 399bp. Trong khi đó các loại vi
sinh vật khác thuộc Listeria spp không có loại gen chuyên biệt này nên không
có xuất hiện vạch 399bp trên ảnh gel doc (Hình 4.1). Qua đó đưa ra kết luận:
Ghi chú:
Lino: Listeria innocua Liva: Listeri ivanovii
Lm: Listeria monocytogenes
(-): Mẫu âm không chứa vi khuẩn M: Thang DNA
4.2 Xác định độ nhạy của bước khuếch đại DNA trong kỹ thuật PCR một
bước trong việc phát hiện Listeria monocytogenes: Sau khi tiến hành tăng sinh Listeria monocytogenes trong môi trường lỏng BHI trong 24 giờ, chúng
tôi tiếp tục xác định nồng độ của vi khuẩn trong ống bằng cách so sánh với độ
đục chuẩn với McFarland và xác định được nồng độ của Listeria
monocytogenes trong ống môi trường BHI la khoảng 108 tế bào/ml xem đây là 100 và ta tiến hành pha loảng nồng độ ra dãy thập phân: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8. Trên mỗi nồng độ tiến hành chạy PCR và cấy đĩa trên môi trường PCA. Kết quả chạy PCR được thể hiện ở Bảng 4.3
Hình 4.1 Kết quả thí nghiệm xác định độ đặc hiệu của
phương pháp PCR đối với Listeria monocytogenes
Bảng 4.2 Kết quả thí nghệm xác định độ nhạy Nồng độ 10-1 10-2 10-3 10-4 Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả Số tế bào cho vào đọc được trên PCA Kết quả Ngày phân tích Độ lặp lại 10/4 1 2 3 4 5 Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 130000 Pos Pos Pos Pos Pos 12500 ND ND Pos Pos Pos Tỷ lệ dương tính 100% 100% 100% 60% 10-5 10-6 10-7 10-8 10/4 1 2 3 4 5 1250 ND ND ND ND ND 130 ND ND ND ND ND 13 ND ND ND ND ND 1 ND ND ND ND ND Tỷ lệ dương tính 0% 0% 0% 0%
Ghi chú: Pos: Kết quả dương tính ND : Kết quả âm tính
Tính toán LD50
Giá trị L: L = log130000 (Mật độ tế bào thấp nhất tại đó có 100% đều cho kết quả dương tính)
Giá trị d: d = log10 (Hệ số pha loãng)
Các giá trị pi: p1 = 1,0 (100% dương tính tại mật độ tế bào thấp nhất) p2 = 0,6 (Tỉ lệ dương tính)
∑pi = 1,6
Theo công thức tính toán LD50 – phương pháp Speaman- Karber Mục 3.3.2.4
Um = 0,96 m- 2SQRT(Um) = 2,05 m+2SQRT(Um)=5,97 Cận trên : 10230,88 Cận dưới : 10237.97
Kết luận: giới hạn phát hiện của bước khuếch đại DNA trong kỹ thuật PCR
một bước đối với Listeria monocytogenes là LD50 = 10233 (số liệu làm tròn từ LD50=10232,93). Với độ tin cậy 95% LD50 nằm trong khoảng 10231 - 10238 tế bào (làm tròn từ cận trên và cận dưới).
Ghi chú:
M: Thang DNA
(-): chứng âm không chứa vi khuẩn Listeria monocytogenes
1: Nồng độ 10-1 5: Nồng độ 10-5 2: Nồng độ 10-2 6: Nồng độ 10-6 3: Nồng độ 10-3 7: Nồng độ 10-7 4: Nồng độ 10-4 8: Nồng độ 10-8
4.3 Xác đinh độ lặp lại của phương pháp PCR một bước: Chúng tôi tiến
hành bố trí thí nghiệm lặp lại 10 lần cho các khuẩn lạc của chủng Listeria
monocytogenes được phân lập trên lôi trường ALOA để kiểm tra độ ổn định
của phương pháp. Kết quả được nêu ở Bảng 4.1
Hình 4.2 Độ nhạy của kỷ thuật PCR đối với Listeria monocytogenes.
Bảng 4.3: Kết quả thí nghiệm xác định độ lặp lại
Số lần lặp lại Tỷ lệ dương tính 10 10/10
(-) : Mẫu trắng không có Listeria monocytogenes. LM: Mẫu có chứa Listeria monocytogenes.
M : Thang DNA; 36bp-955bp
Kết luận: Với 10 lần phân tích cho tỷ lệ dương tính là 100%. Như vậy dựa vào
Bảng 4.3 và Hình 4.3 cho thấy phương pháp định tính Listeria monocytogenes
bằng kỹ thuật PCR một bước ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm.
4.4 Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp
phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004: Kết quả thí
nghiệm này dựa trên kết quả thí nghiệm 1và 2 và kết quả phân tích đồng thời
10 mẫu cá tra phi lê nhiễm chủng Listeria monocytogenes trên hai phương
pháp PCR một bước và ISO 11290 – 1:2004. Đối với phương pháp định tính
chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 trên mẫu cá có độ đặc hiệu cho Listeria monocytogenes ở các phép thử sinh hóa, độ nhạy LD50 = 12 với độ tin cậy 95% LD50 nằm trong khoảng 9-15 tế bào/25gam, độ lặp lại ở
mức L= 45 là 100% (Báo cáo thẩm tra phương pháp phân tích định tính
Listeria monocytogenes trong thực phẩm ISO 11290-1:2004 của Trung Tâm chất lượng, an toàn vệ sinh & thú y thủy sản vùng 6)
Phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monnocytogenes bằng
399bp
Hình 4.3: Xác định độ lặp lại của bước khuếch đại DNA.
M L.M L.M L.M L.M L.M (-) 399bp
tương đương với phương pháp chuẩn ISO11290 – 1:2004 dựa trên tổng hợp kết quả thí nghiệm 1và 2 và kết quả phân tích 10 mẫu cá tra phi lê bị nhiễm
Listeria monnocytogenes đồng thời trên hai phương pháp (Bảng 4.4).
Bảng 4.4 Xác định độ tương đồng
Qua Bảng 4.4 ta kết luận được rằng: Phương pháp định tính nhanh chỉ tiêu
Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật PCR so với phương pháp định tính chỉ
tiêu Listeria monocytogenes theo ISO11290 -1:2004 cho kết quả phân tích
tương đồng nhau và cho thấy được ưu khuyết điểm của hai phương pháp thể hiện ở Bảng 4.5
Phương pháp Tên thí
nghiệm
PCR một bước ISO 11290-1:2004
1 Độ đặc hiệu Đặc hiệu cho vi khuẩn
Listeria monocytogene
Chọn lọc khuẩn lạc
Listeria spp. Trên môi
trường ALOA, Oxford Đặc hiệu các phép thử sinh hóa 2 Độ lặp lại 100% 100% 3 Thử nghiệm song song hai phương pháp
10 mẫu nhiễm Listeria
monocytogenes được thực
hiện trên kỷ thuật PCR cho kết quả đúng với thử nghiệm sinh hóa là 92%.
10 mẫu nhiễm Listeria
monocytogenes trên
ALOA , Oxford cho kết quả đúng với thử nghiệm sinh hóa là 80%
Bảng 4.5 So sánh ưu khuyết điểm của hai phương pháp PCR một bước và ISO 11290-1:2004
Trên ALOA khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình có màu xanh da trời,
khuẩn lạc bóng lồi, đường kính khuẩn lạc từ 1- 4mm sau 24 giờ, xung quanh khuẩn lạc có quầng trắng đục mờ bao quanh (Hình 4.4 )
Môi trường ALOA chứa các chất ức chế như Sodium Chloride, Lithium Chloride, Disodium hydrogen phosphate ức chế một số vi sinh vật khác không
phải là Listeria spp. Mặt khác trong môi trường nền của ALOA có 5-Bromo-1-
β Tên phương pháp
Khuyết điểm Ưu điểm
1 ISO 11290- 1:2004
Thời gian để cho kết quả đối với trường hợp dương tính lên đến 7 ngày
Chi phí thấp hơn so với các phương pháp khác
2 PCR một bước
Chi phí cao hơn so với phương pháp chuẩn ISO 11290-1:2004. Cần có các thiết bị đắt tiền như máy luân nhiệt, máy điện di, máy chụp ảnh gel doc…
Cho kết quả tương đồng với phương pháp chuẩn ISO11290-1:2004, không cần tiến hành các phép thử sinh hóa nên rút ngắn được thời gian cho kết quả xuống còn 2-3 ngày
Môi trường ALOA
hệ enjymeβ-D- Glucosidase của Listeria monocytogenes bẻ gãy liên kết của
chất nền 5-Bromo-1-Chloro-3- Indolyl-β-D- Glucosidase tạo gốc 5-Bromo-1-
Chloro-3- Indolyl có màu xanh vì vậy khuẩn lạc Listeria monocytogenes phát
triển trên ALOA sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh. Mặt khác trong supplement 2 có Phosphatidylinositol kích thích hoạt động của enzyme Phospholipase trong
Listeria monocytogenes phân giải Lipid và protein tạo vùng tủa trắng đục mờ
xung quanh khuẩn lạc.
(-) : Mẫu trắng không có Listeria monocytogenes. LM: Mẫu có chứa Listeria monocytogenes.
M : Thang DNA; 36bp-955bp
Hình 4.5 Kết quả phân tích mẫu cá tra nhiễm Listeria
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận
Mồi được thiết kế trong phương pháp PCR một bước(HlyF1/R1) đặc hiệu phát
hiện ra Listeria monocytogenes.
Độ nhạy của bước khuếch đại DNA trong kỹ thuật PCR một bước là LD50=10233 tế bào.
Độ lặp lại của phương pháp PCR một bước là 100%.
Kết quả thí nghiệm song song của hai phương pháp PCR và ISO 11290- 1:2004 cho thấy phương pháp PCR một bước cho kết quả phân tích tương đồng với phương pháp chuẩn ISO 11290 – 1:2004.
Thời gian cho kết quả của phương pháp PCR một bước là hai đến ba ngày ngắn hơn nhiều so với phương pháp ISO 11290 - 1:2004 là từ bốn đến bảy ngày.
Chi phí của phương pháp PCR một bước cao hơn trung bình 50.000 so với phương pháp truyền thống ISO11290-1:2004 cho mỗi mẫu thử.
5.2 Đề xuất
Do phương pháp này có thể rút ngắn thời gian phân tích Listeria
monocytogenes xuống còn 2-3 ngày nên chúng tôi đề nghị nên áp dụng
phương pháp này rộng rãi trong các phòng kiểm nghiêm vi sinh thực phẩm. Ngoài ra nên tiến hành nghiên cứu thêm trong việc ứng dụng kỹ thuật PCR để
PHỤ LỤC HÌNH
Hình H.2 Khuẩn lạc của Listeria invanoi và Listeria innocua trên ALOA
Hình H.3 Khuẩn lạc của Listeria monocytogenes trên môi trường
Oxford
Đường Xylose va Rhamnose Listeria monocytogees Xylose (-)
Hình H.4 Thử nghiệm sử dụng đường Xylose và Rhamnose
Hình H.5 Thử nghiệm tan huyết cho Listeria monocytogenes,
Listeria innocua, Listeria ivanoi
Hình H.8: Buồn nhiệt Hình H.9 : Máy ly Tâm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Văn Hùng - Xác định nguyên nhân lây nhiễm và đề xuất các giải
pháp kiểm soát mối nguy Listeria monocytogenes trong chế biến cá tra,
2009.
2. Trần Linh Thước – Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm – NXB Giáo dục
3. Cao xuân Hiếu, Trương Quốc Phong – Cẩm Nang Sinh Học Phân Tử- NXB Giáo dục
4. Nguyễn Đức Lượng – Vệ sinh an toàn thực phẩm – NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
5. Embarek, P.K.B. and Hus, H.H. 1993. Heat resistance of
Listeria.monocytogenes in vacuum packaged pasteurized fish fillet.
Intl.J.Food Microbiol. 8:95-98.
6. Ben Embarcked, P.K. 1994: Presence, dection and growth of
Listeria.monocytogenes in seafood; a review. International Journal of
Food Microbiology 23:17-34.
7. FDA 2000, Listeria monocytogenes, Chapter 17.
8. P J Bremer, G c Fletcher & C Osborne, May 2003, Listeria
monocytogenes in seafood, Newzeland Insitute for Crop & Food
Research Limited A Crown Research Institute.
9. . Hornes, E., Y. Wasteson, and Ø. Olsvik. 1991. Detection of
Escherichia coli heat-stable enterotoxin genes in pig stool specimens by
an immobilized, colorimetric, nested polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 29:2375-2379.
10. Karch, H., and T. Meyer. 1989. Single primer pair for amplifying segments of distinct Shiga-like toxin genes by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27:2751-2757.
11. Lu, Y., C. Toma, Y. Honma, and M. Iwanaga. 2002. Detection of EspB using reversed passive latex agglutination: application to determination
of enteropathogenic Escherichia coli. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.
43:7-12.
12. Nagano, I., M. Kunishima, Y. Itoh, Z. Wu, and Y. Takahashi. 1998.
Detection of verotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 by
multiplex polymerase chain reaction. Microbiol. Immunol. 42:371-376. 13. Mattingly, J.A.,B.T. Butman, M.C Plank, and R.J. Durham. 1988.
Arapid monoclonal antibody-based ELISA for the detection of Listeria
in food products. J. Assoc.Off. Anal. Chem. 71:669-673. 13. www.Wikipedia.Com.vn