- Gen ALDH2 mã hóa cho enzym ALDH2 của ty thể. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 12, nhánh dài, vùng 2, băng 4 (12q24). Hay nói cách khác là gen ALDH2
nằm ở cánh dài nhiễm sắc thể số 12, vị trí 24.2 (12q24.2).
- Chính xác hơn, vị trí của gen ALDH2 là từ cặp Nucleotide 111,766,886 đến cặp Nucleotide 111,809,984 trên NST số 12 (hình 1.3).
Hình 1.3. Vị trí của gen ALDH2 trên nhiễm sắc thể số 12 ở ngƣời 1.3.2. Chức năng của gen ALDH2
- Các enzyme mã hóa bởi gen ALDH này thuộc về họ Aldehyd dehydrogenase của các enzym xúc tác biến đổi hóa học từ acetaldehyde để thành acid acetic.
- Enzyme ALDH có hai đồng dạng lớn là: bào tương và ty lạp thể, có thể được phân biệt bởi tính điện di linh động, tính chất động học.
- Enzyme ALDH2 gồm có 517 acid amin, trọng lượng phân tử là 56000 Dalton.
- Enzyme ALDH2 được thấy ở một vài mô trong cơ thể người với nồng độ cao nhất ở mô gan. Vị trí tồn tại cũng như hoạt động của nó là chất nền của ty thể. Enzyme ALDH2 tham gia vào quá trình chuyển hóa rượu tại gan trong cơ thể, chính xác hơn là nó xúc tác biến đổi hóa học từ acetaldehyde thành acid acetic.
1.3.3. Tính đa hình của gen ALDH
1.3.3.1. Tính đa hình của gen
Genome của loài người có những biến thể di truyền khác nhau và điểm đó làm nên sự khác nhau giữa các cá thể trong cộng đồng. Phần lớn những biến thể đó là do sựkhác biệt của hàng triệu các điểm đa hình tại những vị trí Nucleotide nhất định nằm giải rác trên toàn bộ genome đã làm thay đổi mã di truyền hoặc làm thay đổi hoạt động của gen. Những điểm khác biệt đó được gọi là những điểm đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphisms, SNP). Về mặt tiến hóa, những điểm khác biệt này được giả thuyết là các dạng đột biến trung tính tạo nên sự đa dạng về mặt di truyền giữa các cá thể loài người. Tuy nhiên, một số điểm đa hình SNP có thể liên quan đến khả năng mẫn cảm với bệnh [58], [37], [27].
1.3.3.2. Tính đa hình của gen ALDH2
Trong cùng một cách thức như ADHs của người là tính đa hình, trình tự mã hóa của gen ALDH2 ở người mang một sự thay đổi một Nucleotide có tính chất quyết định tại codon 487 (G
A trong exon thứ 12, nghĩa là GAA đối với allen ALDH2.1 và AAA đối với ALDH2.2). Ở cấp độ Protein, sự đa hình gen tương ứng với sự thay thế Glutamat (dạng 1) thành Lysine (dạng 2) dẫn đến việc không hoạt hóa sự hoạt động của Enzyme. Trong các dị hợp tử, sự bất thường của allen ALDH2 trội hơn so với allen ALDH1 bởi vì sự liên hợp giữa allen ban đầu và alen đột biến làm bất hoạt các protein nhiều đơn vị [63].
Một vài nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng được tiến hành để xác định tần số của ALDH2.2 ở người bình thường và người người nghiện rượu. Thông thường, kiểu hình của ALDH được biểu diễn bằng sự điện dihoặc từ việc sinh thiết gan. Phương pháp này có thể không đáng tin cậy vì sự bất hoạt của ALDH trong hệ Protein. Vì mục đích xác định sự đa hình của gen A2, ta cải tiến bằng phương pháp giải trình tự gen ALDH ty thể từ mẫu máu, lỏng hoặc khô trên giấy lọc. Hai allen này được phân biệt với nhau thông qua kết quả cắt giới hạn sau PCR và gây đột biến trong vùng đa hình của gen.
Trong điều kiện sinh lý bình thường thì acetaldehyde sinh ra trong tế bào sẽ lập tức được chuyển hóa thành acetate là một chất không độc nhờ hoạt tính của ALDH (giai đoạn 2). Tuy nhiên nếu cơ thể tiếp xúc với một lượng chất cồn quá nhiều, trong một khoảng thời gian dài và cùng với những thay đổi trong hoạt tính của ADH, CYP2E1 và ALDH, có thể do đột biến hay do tác động bởi các kiểu gen khác nhau sinh ra từ các SNP, thì lượng acetaldehyde tăng cao và sẽ là nguồn gốc cho sự hình thành và phát triển ung thư[46], [72].
Hình 1.4. Sơ đồ quá trình chuyển hóa ethanol tại gan
Rượu được chuyển hóa thành acetaldehyde nhờ hoạt tính enzym của ADH và CYP2E1. Acetaldehyde là một chất có độc tính tiếp tục được chuyển hóa thành một chất không độc acetate nhờ ALDH (hình 1.4). Hiện tượng đa hình thái của ADH và ALDH tạo ra các kiểu gen khác nhau có thể gây tích lũy acetaldehyde và dẫn đến sự phát sinh phát triển ung thư.
Gen ALDH2 có các đa hình đơn (SNP) tạo ra các isoenzym có thuộc tính động học khác nhau. Sự thay đổi 2 acid amin tại các vị trí xác định trên gen ALDH2 (exon 12) tạo ra 2 alen đa hình thái là ALDH2*1 và ALDH2*2. Enzym được mã hóa bởi alen ALDH2*1 có Glu ở vị trí 487. Enzym được mã hóa bởi alen ALDH2*2 có Lys ở vị trí 487, là enzym có hoạt tính thấp, gần như bất hoạt trong việc chuyển hoá acetaldehyde thành acetate.
Tỷ lệ alen ALDH2*2 bất hoạt phổ biến ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên. Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp ở người Châu Âu hoặc Châu Phi[64], [32].
Sự đa hình thái của gen mã hóa cho các enzym ALDH2 làmcho các enzym có hoạt tính thay đổi. Alen ALDH2*1 mã hoá enzyme có khả năng oxy hóa acetaldehyd trong khi alen ALDH2*2 mã hoá enzyme gần như mất hoạt tính.
Trong một quần thể hay nhiều quần thể khác nhau, thì tốc độ chuyển hóa rượu của từng cá thể khác nhau tùy thuộc cá thể đó mang kiểu gen và alen ALDH2 nào
[9]. Vì vậy, bên cạnh rượu có ảnh hưởng gián tiếp đến tổn thương các tế bào và mô cơ quan trong cơ thể thì yếu tố di truyền là yếu tố nguy cơ quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư.
1.3.4. Gen ALDH2 và bệnh ung thư
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự tác động sự đa hình thái của genALDH2 và lượng rượu tiêu thụ của bệnh nhân có nguy cơ gây ra một số loại ung thư.
- Gen ALDH2 và ung thư đại trực tràng(UTĐTT).
Hua Zhao và cộng sự (2014) công bố nghiên cứu phân tích tổng hợp nhiều nghiên cứu khác nhau để tìm mối liên quan đa hình thái Glu487Lys của gen ALDH2 với nguy cơ UTĐTT [72]. Kết quả phân tích 11 nghiên cứu bệnh-chứng trên 2909 bệnh nhân và 4093 người thuộc nhóm chứng cho thấy những người có chứa alen ALDH2*2có nguy cơ UTĐTT thấp hơn.
- Gen ALDH2 và ung thư thực quản
Tác giả Ming Wu và cộng sự (2013) đã so sánh yếu tố nguy cơ của ung thư thực quản liên quan đến mức độ tiêu thụ rượu giữa những người mang kiểu gen
ALDH2*1/*1 với người mang kiểu gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 và đồng hợp tử
ALDH2*2/*2. Kết quả nghiên cứu trên 858 bệnh nhân ung thư thực quản và trên nhóm chứng 1081 người Trung Quốc đã cho thấy người uống rượu trung bình - nhiều và mang gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 có nguy cơ mắc ung thư thực quản cao nhất (OR=2,34, 95% CI: 1,52-3,61) so với nhóm người không hoặc uống rượu ít có gen đồng hợp tử ALDH2*1/*1[67].
1.4. Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH21.4.1. Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP) 1.4.1. Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP)
Hiện tượng SNP hay hiện tượng đa hình đơn Nucleotide là sự khác nhau về trình tự DNA khi một Nucleotide đơn A, C, T hay G trong một chuỗi ADNtương ứng (Hình 1.5) giữa các cá thể của một loài hay giữa các cặp NST của một cá thể.Bộ gen người có 23 cặp NST, trong đó có 22 cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính chứa khoảng 3,2 tỷ bp. Kết quả của dự án giải trình tự gen người cho thấy trình tự các nucleotid giống nhau đến 99,9% giữa các cá thể và sự khác nhau ở 0,1% còn lại biểu hiện bằng các đa hình đơn. Chính sự khác nhau này đã quy định đặc điểm riêng của mỗi cá thể, liên quan tính cách, nguy cơ mắc bệnh và sự đáp ứng với điều trị.
SNP là hiện tượng phổ biến theo ngân hàng dữ liệu của NCBI tính đến tháng 26/6/2012 có hơn 53 triệu SNPs ở người, xảy ra tần số khá cao từ 1/1000 bp đến 1/100-300 bp. SNP được coi là hậu quả của đột biến điểm thay thế một cặp Nucleotide.
SNP xảy ra ở cả vùng mã hóa và vùng không mã hóa của gen. Các SNP tại vùng mã hoá của gen có thể làm thay đổi hoặc không làm thay đổi trình tự các acid amin và cấu trúc phân tử protein mà nó tạo ra. Hầu hết các SNP xảy ra ở vùng không mã hóa và không làm thay đổi cấu trúc của gen, tuy nhiên các SNP có thể nằm ở vùng điều hoà của gen, làm thay đổi mức độ sao chép gen hay ảnh hưởng đến quá trình hoàn thiện RNA thông tin.
Dựa vào trình tự acid amin của của phân tử protein do gen tổng hợp có thể chia làm 2 loại
- Biến đổi im lặng là những biến đổi không làm thay đổi sản phẩm gen, ví dụ bộ ba mã hóa GAC và GAG đều mã hóa cho acid amin leucine, không thay đổi cấu trúc phân tử protein.
- Biến đổi sai nghĩa là những biến đổi làm thay đổi trình tự chuỗi polynucleotide của ARN, do đó làm thay đổi trình tự chuỗi acid amin của phân tử
protein. Thông thường những biến đổi dạng này làm thay thế một acid amin bằng acid amin khác.
Những đột biến trên có thể dẫn tới sự thay đổi chức năng gen. Các dạng biến đổi này có thể xảy ra ở bất kỳ bộ ba mã hoá nào cũng như tại các vị trí cắt, ghép nối extron và intron.
Ngoài ra, SNP trong vùng mã hóa, làm thayđổi cấu trúc phân tử protein ở nhiều mức độ khác nhau. Ví dụ nếu SNP làm cho mã GAU thành GAG thay đổi acid amin từ aspartic thành glutamic, hai acid amin này có tính chất hóa học rất giống nhau. Nếu SNP này chỉ làm thay đổi một phần protein và không phải quan trọng với chức năng của nó, thì kết quả hoàn toàn vô hại. Trong điều kiện bình thường sự thay đổi SNP là tiềm ẩn, nhưng chỉ khi tiếp xúc với các tác nhân có hại môi trường như chất gây ung thư, hóa chất…thì chúng hoạt hóa và biểu hiện bệnh.
Như vậy sự khác biệt trong trình tự DNA ở người có thể ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh tật, sự đáp ứng với tác nhân gây bệnh, hóa chất, thuốc, và vacxin và các tác nhân khác. Do đó, ứng dụng lớn nhất của SNP trong nghiên cứu y sinh học là so sánh các vùng gen giữa các nhóm đối tượng khác nhau (nhóm người không bị bệnh và nhóm người bị bệnh) để từ đó tìm ra mối liên quan giữa SNP với bệnh, từ đó tìm ra yếu tố nguy cơ đối với sự hình thành và tiến triển bệnh.
SNP và mối liên quan đến ung thư
Hiện nay các nhà khoa học đang cố gắng xác định SNP khác nhau trong bộ gen con người, và thiết lập hồ sơ SNP cho mỗi cá thể và xếp chúng theo nhóm (SNP profiles). SNP profiles có thể giúp xác định gen ung thư, và xác định yếu tố nguy cơ có liên quan đến ung thư trong các quần thể lớn.
Hình 1.5. Minh họa hiện tƣợng đa hình đơn nucleotide(SNP)
Nguồn SNP - Google Search.htm
1.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn nucleotide:
1.4.2.1. Kỹ thuật PCR
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotide tự do. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước như sau:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,
Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động xúc tác quá trình tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuyếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm khuôn mẫu để tổng hợp các đoạn DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là các đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài xác định là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi[8].
Bƣớc 1: biến tính
Bƣớc 2: bắt cặp
Bƣớc 3: tổng hợp
Hình 1.6. Nguyên lý kỹ thuật PCR
1.4.2.2. Kỹ thuật PCR-RFLP
- Nguyên lý: PCR-RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzym cắt thích hợp. Các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethidium bromide cho ta biết được tính đa hình thái của đoạn DNA cần phân tích [11].
- Enzym cắt giới hạn:
Enzym cắt giới hạn hay còn gọi enzym hạn chế, enzym cắt là enzym dưới nhóm quan trọng của các enzym endonuclease, enzym này cắt DNA ở các vị trí xác định dựa trên sự nhận biết đoạn trình tự đặc hiệu với từng enzym thành các đoạn DNA có kích thước khác nhau. Enzym cắt giới hạn được dùng để xác định alen liên quan đến các SNP do sự thay đổi 1 nucleotid trong mỗi SNP làm thay đổi đoạn trình tự đặc hiệu nhận biết bởi enzym cắt giới hạn trên đoạn DNA đó .
Bảng 1.2. Vị trí cắt của một số enzym giới hạn
Tên enzym EcoRI EcoRII BamHI SmaI ApaI SspI *
Các enzym giới hạn có đặc điểm sau:
- Đều được chiết tách từ vi khuẩn, và tên của enzym giới hạn mang tên viết tắt của vi khuẩn
- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu (hay gọi vị trí giới hạn) cho từng loại enzym.
- Vị trí cắt thường có 4-8 Nu, đặc trưng quan trọng nhất của trình tự giới hạn là đoạn DNA gồm 4-8 cặp Nu có trình tự giống nhau khi đọc theo chiều 3-5 và 5-3. Vì vậy, vị trí cắt của enzym giống nhau trên cả 2 mạch.
- Sau khi bị cắt, DNA có các đầu kết dính ở các sợi đơn. Cùng bị cắt với cùng loại enzym giới hạn, các phân tử DNA có các đầu kết dính với các Nu bổ sung cho nhau.
Ưu điểm kỹ thuật PCR-RFLP:rẻ tiền, không đòi hỏi máy móc hiện đại. Kỹ thuật đơn giản, dễ dàng áp dụng vào nhiều các nghiên cứu, phân tích chủ yếu đa hình đơn nucleotide.
Nhược điểm: Một vài enzym cắt giới hạn có giá đắt, khó khăn trong việc thiết kế mồi đặc hiệu, và enzym cắt thích hợp để thu được sản phẩm có kích thước khác nhau giúp cho việc nhận định và phân tích kết quả. Quy trình làm thủ công nên mất nhiều thời gian. Hạn chế thấy rõ nhất là khó có thể xác định kiểu gen nếu có nhiều SNPs khác nhau trên đoạn gen bởi nó đòi hỏi nhiều cặp mồi và enzym cắt khác nhau. Hơn nữa, kiểu gen và alen có thể bị nhận định sai nếu enzym cắt sản phẩm gen khuyếch đại không hoàn toàn [11].
1.4.2.3. Kỹ thuật giải trình tự gen
Hiện nay, người ta sử dụng máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc của Sanger. Với các máy thế hệ mới sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng mà