Hệ thống máy giải trình tự của Illumina sử dụng công nghệ giải trình tự theo phương pháp tổng hợp (Sequencing by Synthesis) kết hợp với việc sử dụng các nucleotide có gắn tín hiệu huỳnh quang và khóa dừng thuận nghịch để đọc và nhận biết trình tự một cách trực tiếp.
Nguyên tắc của công nghệ giải trình tự của Illumina cũng giống với giải trình tự bằng điện di mao quản. ADN polymerase xúc tác cho quá trình ghép các deoxyribonucleotide triphosphates được gắn huỳnh quang vào mạch khuôn ADN trong suốt các chu kì tổng hợp. Trong suốt mỗi chu kì, tại nucleotit có sự kết hợp sẽ được phát hiện bằng các bức xạ huỳnh quang. Đặc điểm khác nhau ở đây chính là thay vào việc chỉ giải trình tự trên một sợi ADN, công nghệ giải trình tự thế hệ mới cho phép giải trình tự đồng thời nhiều gen cùng một lúc. Công nghệ giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (SBS) sẽ đưa ra kết quả có sự chính xác cao, tăng tỉ lệ đọc được của các đoạn ADN. Quy trình giải trình tự thế hệ mới gồm có 4 bước chính:
Chuẩn bị thư viện (Library Preparation)
Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH
Bao gồm việc chuẩn bị thực hiện theo quy trình của bộ kit ForenSeq DNA Signature Prep. Mẫu sẽ được khuếch đại những đoạn ADN đặc hiệu và gắn thêm các adapter riêng biệt để có thể phân biệt giữa các mẫu với nhau. Cuối cùng, các mẫu sẽ được trộn lại chung và đưa vào máy giải trình tự.
Tạo Cluster
Thư viện sau khi được chuẩn bị sẽ được máy đưa tự động lên flow cell – nơi có các đoạn nhỏ oligo nucleotit đã được gắn lên trên bề mặt có sự tương thích với các adapter. Mỗi đoạn sẽ khuếch đại riêng biệt và tách thành từng nhóm cluster thông qua phản ứng khuếch đại đường cầu. Sau quá trình tạo ra các cluster thì mạch khuôn đã sẵn sàng cho việc giải trình tự
Giải trình tự
Giải trình tự bằng công nghệ tổng hợp. Kết quả có độ chính xác đến từng base.
Phân tích kết quả
Hệ thống có server đi kèm sử dụng phần mềm riêng biệt để phân biệt và so sánh các mẫu với nhau.
Chuẩn bị thư viện
Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH
Tạo Cluster
Giải trình tự
Hình 1.3. Quy trình giải trình tự thế hệ mới của Illumina
1.4.2 Giải pháp NGS cho lĩnh vực hình sự của Illumina [23]
Hệ thống MiSeq FGx là hệ thống được hãng Illumina giới thiệu sử dụng riêng cho hình sự. Hệ thống được ra mắt vào tháng 1 năm 2015 và đã được đứng thứ hai trên top 10 danh sách các sản phẩm khoa học đổi mới cho năm 2015.
Hệ thống MiSeq FGx đang được đánh giá là một giải pháp hoàn chỉnh cho lĩnh vực hình sự. Với những đặc điểm như:
- Chỉ sử dụng một bộ kit duy nhất hoàn thiện phân tích được cả 2 chỉ thị ADN trong hình sự là STRs và SNPs.
- Tổng số dấu chuẩn trong bộ kit chuẩn bị thư viện là 233. Từ đó cung cấp được lượng thông tin lớn mang độ tin cậy và chính xác cao
- Kết hợp đồng thời các STR trên nhiễm sắc thể thường (28 locus), nhiễm sắc thể giới tính Y (24 locus) và nhiễm sắc thể giới tính X (7 locus). Bên
Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH
cạnh đó còn có 94 SNPs mang thông tin giúp phân biệt và nhận diện cá thể.
- Kích thước của các đoạn amplicon sau khi khuếch đại từ 60 – 460bp. Điều này có ý nghĩa khi phân tích các mẫu bị đứt gãy mạnh, các mẫu có chất lượng kém và mẫu xương.
- Có khả năng dự đoán được kiểu hình và nguồn gốc chủng tộc của cá thể do có chứa các ancestry SNPs và phenotyping SNPs
- Số lượng mẫu tối đa có thể thực hiện được là 96 mẫu
- Lượng ADN khuyến cáo tương đối thấp 1ng.
- Tất cả mọi hóa chất phải sử dụng đều được gói gọn trong bộ kit.
Hình 1.4. Bộkit chuẩn bị thư viện ForenSeqTMDNA Signature Prep
1.4.3 Tình hình thực tế ở Việt Nam
Hiện nay ở Việt Nam, giải trình tự bằng phương pháp điện di mao quản vẫn đang là tiêu chuẩn vàng trong phòng giám định gen của Viện Khoa học Hình sự. Tuy nhiên sau một thời gian dài sử dụng, những giới hạn về mặt công nghệ của phương pháp cũ cũng đã xuất hiện mà vẫn chưa có giải pháp cụ thể nào giải quyết những trường hợp án khó.
Tháng 3 năm 2015, Viện đã bắt kịp và cũng là một trong những đơn vị đầu tiên mua và cài đặt hệ thống máy MiSeq FGx của Illumina. Để đánh giá thực tế những lợi thế của máy MiSeq FGx mang lại, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Đánh
giá bộ kit ForenSeq trên hệ thống MiSeq FGx ứng dụng trong định danh cá thể ngƣời Việt Nam”. Đề tài được thực hiện ở Trung tâm giám định Sinh học pháp
Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH
lý - Viện Khoa học Hình sự và Trung tâm dịch vụ và phân tích di truyền - GENTIS dưới sự hỗ trợ của công ty BIOMEDIC và hãng ILLUMINA
Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH
Tài liệu tham khảo Tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Đức (2002), Phương pháp kiểm tra thống kê Sinh học, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội
2. Phạm Xuân Kiều (2005), Giáo trình Xác suất và thống kê, NXB GD, Hà Nội
Tiếng Anh
3. Bentley D. R. (2006), “Whole-genome resequencing”, Current Opinion in Genetics & Development, 16 (6), pp. 545-552
4. Buckleton J., Triggs C. M., Walsh S. J. (2005), “Forensic DNA evidence interpretation”, CRC Press, USA
5. Butler J. M. (2011), “Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology”,Academic Press, China
6. Butler J. M., Coble M. D., Vallone P. M. (2007), “STRs vs SNPs: thought on the future of forensic DNA testing”, Forensic Sci Med Pathol, 3, pp. 200-205
7. ILLUMINA (2015), ForenSeqTMDNA Signature Prep Reference Guide, Illumina, San Diego.
8. ILLUMINA (2015), MiSeq FGxTMInstrument Reference Guide, Illumina, San Diego.
9. ILLUMINA (2011), CASAVA v1.8.2 User Guide, Illumina, San Diego
10. Jennifer D. C. (2016), “Evaluation of the Illumina® Beta Version ForenSeqTM DNA Signature Prep Kit for use in genetic profiling”,
ForensicScience International: Genetics, 20, pp. 20-29.
11. Juan J. S. (2006), “A multiplex assay with 52 single nucleotide
polymorphisms for human identification”, Electrophoresis, 27, pp. 1713- 1724.
Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH
12. Kobilinsky L., Levine L.; Margolis – Nunno H. (2007), “Forensic DNA Analysis”, Chelsea House, USA.
13. Mardis E. R. (2008), “The impact of nextgeneration sequencing technology on genetics”, Trends in Genetics, 24 (3), pp. 133-141.
14. Martin P. D., Schmitter H., Schneider P.M. (2001), “A brief history of the formation of DNA databases in forensic science within Europe”, Forensic Science International, 119 (2), pp. 225-231.
15. Patel J. (2014), “Forensic Conception: DNA typing of FTA Spotted
Samples”, Journal of Applied Biology & Biotechnology, 2(10), pp. 021-029.
16. Rothberg J. M., Hinz W., Rearick T. M., Schultz J. et al. (2011), “An integrated semiconductor device enabling non – optical genome sequencing”,
Nature, 475 (7356), pp. 348-352.
17. Stefano C. (2015), “MiSeq FGx sequencing system: A new platform for forensic genetics, Forensic Science International: Genetics Supplement Series 5, pp. 98-100.
18. Walsh P. S. (1991), “Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR – based typing from forensic material”, BioTechniques,10(4), pp. 506-513.
19. Wing Kam Fung, Yue – Qing Hu (2008), Statistical DNA Forensic: Theory, Methods and Computation, John Wiley & Sons, Hong Kong.
20. Yang Y., Xie B., Yan. (2014), “Application of Next – Generation Sequencing Technology in Forensic Science”, Genomicis Proteomics Bioinformatics, 12 (5), pp. 190-197
21. Zagorski N. (2006), “Profile of Alec. J. Jeffreys”, PNAS, 103 (24), pp. 8918- 8920
22. http://www.illumina.com/documents/products/techspotlights/techspotlight_s
equencing.pdf
Luận văn cao học - 2016 Nguyễn Thị Hồng Nhung – K23CH
23. http://www.illumina.com/content/dam/illumina-
marketing/documents/products/datasheets/miseq-fgx-system-spec-sheet- 1470-2014-004.pdf