2.3.2.1. Đánh giá ích thước, phân bố ích thước ti u phân và thế zeta
. Đánh giá KTTP trung b nh và PDI
Nguyên tắc xác định KTTP: KTTP đự c xác định bằng phương pháp tán x ánh sáng động (dynamic light scattering). Khi chiếu 1 chùm ti l ser vào hệ, ánh sáng tán x t tiểu phân đư c h ng lên 1 màn chắn. Phân tích sự d o động c cường độ ánh sáng tán x t c thể đánh giá đư c chuyển động Brown và đánh giá kích thước h t nhờ phương tr nh Stockes - Einstein.
Tiến hành: Tiểu phân n no s u ly tâm và rửa 2 lần bằng nước cất đư c phân tán vào một lư ng nước cất v đ (10 ml) sao cho tốc độ đếm (count rate) nằm trong khoảng 200 - 400 kcps. Tiến hành đo mẫu trên máy Zet sizer ở nhiệt độ 25°C, sử dụng cuvet nhựa.
b. Đánh giá thế zet c tiểu phân n no
Nguyên tắc xác định thế zet : Khi đ t 1 điện trường lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển v phí điện cực trái dấu với v n tốc tỷ lệ với thế zet . Tốc độ này đư c xác định bằng việc phân tích chuyển động c tiểu phân thông qu ánh sáng tán x . Thế zet đư c xác định dự vào độ nhớt môi trường và định lu t Smoluchowski-Huckel.
Tiến hành tương tự như phương pháp xác định KTTP trung b nh nhưng sử dụng cuvet nhự c 2 lá điện cực bằng đ ng.
2.3.2.2. hương pháp định lượng DH và xác định hiệu suất mang thuốc, hả năng nạp thuốc
Th m khảo tài liệụ [35], [36] và dựa theo đi u kiện thực nghiệm, tiến hành định lư ng DHA trong các mẫu bằng HPLC với đi u kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: ZORBAX Eclipse XDB- C18 (4,6mm x 250mm, 5- Micron). - Ph động: ACN:Đệm phosph t pH 3,0 60:40, tt/tt) trong đ đệm phosph t g m 4,08 g k li dihydrophosph t trong 1 lít nước cất, đi u chỉnh tới pH 3,0 bằng cid phosphoric. L c qu màng l c kích thước lỗ l c 0,45 µm.
- Detector UV, bước s ng phát hiện: 210 nm. - Tốc độ dòng: 1 ml ph t.
- Thể tích tiêm mẫu: 50 µl.
* ẫu chu n:
19
- Cân chính xác khoảng 10,0 mg nguyên liệu DHA, cho vào b nh định m c 100 ml. Thêm 55 ml ACN, lắc kỹ, đ y kín và siêu âm trong 15 ph t cho t n hết. Bổ sung ACN v đ thể tích, lắc đ u. T dung dịch chuẩn gốc này n ng độ chính xác khoảng 100,0 µg ml), pha loãng bằng dung môi ph mẫu dd1) thành các dung dịch chuẩn c n ng độ nằm trong khoảng 5 đến 100,0 µg ml, l c dung dịch chuẩn qu màng l c kích thước lỗ l c 0,45 µm. Dịch l c đư c tiêm vào hệ thống HPLC để xác định n ng độ DHA trong dung dịch chuẩn.
* ẫu thử:
- Mẫu DHA tự do: Lấy chính xác 2 ml hỗn dịch ch a tiểu phân n no DHA- PLGA, DHA-PLGA/CS-FA cho vào ống ly tâm c màng siêu l c 10000 Da. Tiến hành ly tâm 5000 vòng ph t trong thời gi n 30 ph t ở nhiệt độ 10°C, lấy phần dịch l c trong phí dưới màng siêu l c tiêm vào hệ thống HPLC để xác định n ng độ DHA tự do.
- Mẫu DHA toàn phần: Lấy chính xác 2 ml hỗn dịch n no cho vào b nh định m c 5 ml. Thêm 2 ml ACN, lắc kỹ, đ y kín và siêu âm trong 15 ph t. Bổ sung ACN v đ đến v ch, lắc đ u. L c qu màng l c kích thước lỗ l c 0,45 µm. Dịch l c đư c tiêm sắc ký để xác định n ng độ DHA toàn phần.
* Tính toán ết quả:
- Công th c tính lư ng thuốc tự do:
( )
Trong đó: Std, Sc là diện tích pic c mẫu DHA tự do và mẫu chuẩn mAu.s). Cc là n ng độ c mẫu chuẩn µg ml).
Vt là thể tích c mẫu thử hỗn dịch n no) ml). - Công th c tính lư ng thuốc toàn phần:
( )
Trong đó: Stp, Sc là diện tích pic c mẫu DHA toàn phần và mẫu chuẩn mAu.s). Cc là n ng độ c mẫu chuẩn µg ml).
D là hệ số ph loãng c mẫu DHA toàn phần. Vt là thể tích c mẫu thử hỗn dịch n no) ml).
20
- Công th c tính hiệu suất m ng thuốc:
- Công th c tính khả năng n p thuốc:
LC (%)
́ ̣ ̉ × 100 %)
Trong đó: DHAtp là lư ng DHA toàn phần µg). DHAtd là lư ng DHA tự do µg).
Khối lư ng tiểu phân n no µg) đư c tính bằng tổng khối lư ng dư c chất và tá dư c t o thành n no lý thuyết).
2.3.2.3. hương pháp đánh giá khả năng giải phóng DC từ hệ c a ti u phân nano
Qua tham khảo nghiên c u [1], [38], tiến hành đánh giá khả năng giải ph ng c a DHA t hệ nano bằng cách sử dụng t i thẩm tích (kích thước màng 10000 Da – Membrane Cel, Chicago, IL, USA). Các đi u kiện và các bước tiến hành cụ thể như sau:
- Thiết bị: Máy lắc đi u nhiệt (Shaker Incubator, LSI-100B, Nh t Bản). - Tốc độ lắc: 100 vòng ph t.
- Môi trường giải ph ng: Đệm phosphat pH 7,4 với thể tích 15 ml. - Nhiệt độ môi trường giải ph ng: 37 ± 5°C.
- Lấy mẫu vào các thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ, 9 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. H t chính xác 1 ml môi trường thử bằng pipet, bổ sung 1 ml môi trường mới. - Mẫu thử ch a tiểu phân n no: Ly tâm hỗn dịch nano với tốc độ 5000 vòng ph t trong thời gi n 45 ph t. Lấy 1 ml cuối và cắn ở ống ly tâm c a mỗi quá tr nh ly tâm, s u đ gộp l i thu đư c hỗn dịch đ c. Lắc đ u hỗn dịch n i trên bằng máy lắc xoáy trong 3 ph t, h t chính xác 3 ml hỗn dịch n i trên cho vào t i thẩm tích. Kẹp ch t 2 đầu t i, đ t t i thẩm tích vào ống ly tâm c thể tích 50 ml ch a 15 ml môi trường đệm phosphat pH 7,4 s o cho t i thẩm tích ng p trong đệm.
- N ng độ DHA trong hỗn dịch đ c đư c xác định theo các bước ghi t i mục 2.3.2.2.
- Mẫu chuẩn: Chuẩn bị như mục 2.3.2.2. - Cách tính kết quả:
N ng độ DHA thời điểm t đư c tính theo công th c ghi t i mục 2.3.2.2. EE (%)
21
- Khối lư ng DHA đã giải ph ng r môi trường t i thời điểm t đư c tính bằng công th c:
( )= 15.Ct + 1.∑
Trong đ :
mt là khối lư ng DHA đã giải ph ng r môi trường hoà t n t i thời điểm t µg). Ct là n ng độ DHA trong môi trường thử t i thời điểm t µg ml).
Ci là n ng độ DHA trong môi trường thử t i thời điểm i µg ml). Phần trăm giải ph ng tích luỹ t i thời điểm t đư c xác định bằng công th c:
% DHA giải ph ng t i thời điểm t = x 100 Trong đ :
mt là khối lư ng dư c chất đã giải ph ng t i thời điểm t µg).
mo là khối lư ng dư c chất b n đầu đư vào trong t i thẩm tích µg).
2.3.2.4. Đánh giá tương tác giữa CS-FA và xác định sự có ặt c a FA, CS trên ti u phân nano.
a. Phổ UV-VIS.
Thiết bị: Máy qu ng phổ UV-VIS U-1900, HITACHI.
Tiến hành: Hò t n các mẫu nano DHA-PLGA/CS-FA và DHA-PLGA/CS (trong đ mẫu nano DHA-PLGA CS đư c bào chế bằng cách lấy dung dịch CS trong acid acetic phối h p với nano DHA-PLGA), ph c h p CS-FA và các mẫu nguyên liệu. R i lần lư t quét phổ hấp thụ UV-VIS trong khoảng bước s ng 200 - 400 nm.
b. Phổ FT/IR.
Thiết bị: Máy đo phổ h ng ngo i FT/IR 6700 JASCO.
Tiến hành: Lấy nano DHA-PLGA/CS-FA đã tinh chế đem ti n đông trong t l nh sâu ở nhiệt độ -70°C trong 12 giờ, r i tiến hành đông khô với đi u kiện nhiệt độ khoảng -50°C, áp suất dưới 0,1 mbar sau 24 giờ sẽ thu đư c nano DHA-PLGA/CS-FA d ng bột khô. S u đ lấy mẫu nano d ng bột khô, ph c h p CS-FA và các nguyên liệu lần lư t nghi n, trộn đ u với KBr s u đ d p thành viên tiến hành quét phổ h ng ngo i với dải bước s ng 4000 - 400 cm-1.
22
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả hảo sát phƣơng pháp nh lƣợng
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn DHA c n ng độ lần lư t là 5, 10, 25, 50, 100 µg ml. Tiến hành ch y sắc ký như mục 2.3.2.2, ghi l i đáp ng pic c dãy dung dịch chuẩn trên, t đ xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và n ng độ dư c chất. Kết quả đư c tr nh bày trong các bảng và h nh s u:
Bảng 3.1. Mối tương qu n giữa diện tích pic và n ng độ DHA
N ng độ DHA (μg/mL) 5 10 25 50 100 Tổng diện tích pic và (mAU.s) 65978 118016 270229 558303 1151304
Hình 3.1. Đồ thị bi u diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA
Nh n xét: Kết quả cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và n ng độ DHA, với hệ số tương qu n R2 = 0,9993. Do đ , phương pháp HPLC đư c sử dụng để định lư ng DHA trong các thí nghiệm sau.
3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA- PLGA/CS-FA.
3.2.1. Ảnh hưởng c a một số yếu tố quy trình đến đặc tính c a hệ ti u phân nano DHA-PLGA. DHA-PLGA.
Tham khảo các tài liệu [1], [2], [3], [32] cố định các thành phần công th c c a hệ tiểu phân n no DHA-PLGA như s u: Pha dầu g m 10 mg DHA, 30 mg PLGA, 5 ml DCM. Ph nước là Tween 80 với n ng độ 1,5% trong 50 ml nước cất. Tiến hành khảo sát một số yếu tố quy tr nh ảnh hưởng đến đ c tính c a hệ tiểu phân n no DHA-PLGA như s u: y = 11457x - 2600.5 R² = 0.9993 0 400000 800000 1200000 1600000 0 20 40 60 80 100 120 Diện tích pic (m AU.s) Nồng ộ chuẩn (μg/ml)
23
3.2.1.1. Ảnh hưởng c a th i gian siêu â
Tiến hành bào chế hệ tiểu phân n no DHA-PLGA theo mục 2.3.1.1 với các thành phần công th c đư c cố định như trên, công suất siêu âm là 117 W. Th y đổi thời gian siêu âm t 3 ph t đến 7 ph t. Kết quả đư c thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng c a th i gian siêu â tới đặc tính c a hệ ti u phân nano
DHA-PLGA
Công th c Thời gi n siêu âm KTTPTB (nm) PDI zeta (mV) CT1 3 ph t 129,4 ± 4,0 0,187 ± 0,002 -25,9 ± 0,1 CT2 5 ph t 141,9 ± 3,9 0,165 ± 0,011 -17,6 ± 1,8 CT3 7 ph t 165,4 ± 4,0 0,205 ± 0,011 -13,8 ± 0,1
Nh n xét: T kết quả t thấy thời gi n siêu âm c ảnh hưởng đến KTTPTB, PDI, và thế zet c hệ tiểu phân n no. Khi tăng thời gi n siêu âm t 3 ph t lên 7 ph t th KTTPTB tăng t 129,4 nm lên 165,4 nm đi u này c thể giải thích là thời gi n siêu âm càng lâu càng làm tăng nhiệt độ, tăng chuyển động nhiệt c các tiểu phân nên khả năng kết tụ c các tiểu phân tăng lên làm KTTP tăng. Đ ng thời thế zet c hệ tăng dần t -25,9 lên -13,8 mV. V chỉ số đ phân tán PDI) th t i thời gi n siêu âm 5 ph t th cho kết quả thấp nhất là 0,165, đi u này tương đ ng với NC trước đ [3]. Ngoài r khi thời gi n siêu âm càng lâu th sẽ càng làm gi tăng sự nhiễm t p kim lo i t đầu dò siêu âm. Do đ , thể thu n l i cho quá tr nh nghiên c u tiếp theo tiến hành ch n thời gi n siêu âm là 5 ph t.
3.2.1.2. Ảnh hưởng c a công suất siêu â
Khảo sát công suất siêu âm ảnh hướng đến đ c tính c a hệ tiểu phân n no, tiến hành bào chế hệ tiểu phân n no DHA-PLGA theo mục 2.3.1.1 và cố định thời gian siêu âm là 5 ph t. Khảo sát công suất siêu âm t 65 lên 117 W kết quả thu đư c như bảng 3.3:
Bảng 3.3. Ảnh hưởng c a công suất siêu â tới đặc tính c a hệ ti u phân nano
DHA-PLGA
Công th c Công suất siêu âm KTTPTB (nm) PDI zeta (mV) CT4 65 W 166,9 ± 2,1 0,252 ± 0,032 -20,1 ± 1,3 CT5 91 W 151,9 ± 1,0 0,187 ± 0,014 -18,5 ± 0,1 CT6 117 W 141,9 ± 3,9 0,165 ± 0,011 -17,6 ± 1,8
24
Nh n xét: T kết quả thực nghiệm cho thấy công suất siêu âm ảnh hường đến KTTP trung b nh, PDI nhưng ít ảnh hưởng đến thế zeta c a hệ nano. Khi tăng công suất siêu âm t 65 W lên 117 W th KTTPTB giảm t 166,9 nm xuống 141,9 nm. Đi u này c thể giải thích do tăng công suất siêu sẽ gi p tăng năng lư ng siêu âm t đ làm nhỏ kích thước c các gi t dầu khi phân tán vào ph nước nên KTTP nhỏ. V chỉ số đ phân tán PDI) giảm tử 0,252 xuống 0,165 khi tăng công suất siêu âm t 65 W lên 117 W. Do v y, t i công suất siêu âm 117 W cho kết quả PDI là thấp nhất và KTTP trung b nh là bé nhất nên quyết định ch n công suất siêu âm 117 W để tiến hành khảo sát các thông số khác.
3.2.2. Ảnh hưởng c a tỷ lệ phức CS-FA so với PLGA tới đặc tính c a hệ ti u phân
nano DHA-PLGA/CS-FA.
Tiến hành bào chế hệ tiểu phân n no DHA-PLGA/CS-FA theo mục 2.3.1.1 và mục 2.3.1.2 với các thông số quy tr nh ch n đư c ở mục 3.2.1, cố định tỉ lệ thể tích pha dung dich CS-FA/pha hỗn dịch nanno là 1:1, nhiệt độ gi i đo n hấp phụ CS-FA là 25°C, thời gi n hấp phụ CS-FA lên b m t tiểu phân n no là 30 ph t. Khảo sát ảnh hưởng c a tỷ lệ CS-FA/PLGA với các tỉ lệ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8. Kết quả đư c thể hiện trong bảng 3.4 và h nh 3.2 dưới đây:
Bảng 3.4. Ảnh hưởng c a tỉ lệ CS-F / G đến đặc tính hệ ti u phân nano
DHA-PLGA/CS-FA. Công th c Tỷ lệ ph c CS-FA/PLGA KTTPTB (nm) PDI Zeta (mV) CT7 0,1 162,4 ± 1,6 0,232 ± 0,030 13,2 ± 1,0 CT8 0,2 184,1 ± 4,1 0,247 ± 0,016 19,7 ± 0,9 CT9 0,3 195,3 ± 5,3 0,279 ± 0,003 24,7 ± 0,9 CT10 0,4 214,7 ± 2,2 0,300 ± 0,017 25,0 ± 1,3 CT11 0,6 231,4 ± 2,3 0,319 ± 0,050 30,1± 0,2 CT12 0,8 234,3 ± 3,6 0,420 ± 0,039 27,5 ± 1,5
25
Hình 3.2. Đồ thị ảnh hưởng tỉ lệ CS-F / G đến đặc tính hệ ti u phân nano