3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.7. Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm
Các số liệu thu thập đƣợc sau các thí nghiệm phân tích theo các tham số thống kê gồm giá trị trung bình, trung bình mẫu, độ lệch chuẩn, phân tích thống kê số liệu ANOVA 1 yếu tố và kiểm tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng phƣơng pháp LSD 0,05 của Fisher trên phần mềm Excel 2010 [4].
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Đối với mỗi đối tƣợng khác nhau có nồng độ các chất xử lí, khử trùng thích hợp. Kết quả của bƣớc này phụ thuộc vào: quá trình lấy mẫu, thời điểm, nồng độ chất khử trùng, thời gian thực hiện khử trùng và đặc điểm sinh lí của từng đối tƣợng. Vì vậy, phải xác định đƣợc phƣơng thức khử trùng thích hợp nhất đối với đối tƣợng hoa hồng cổ Sapa.
Thí nghiệm này sử dụng đốt thân của cây hoa hồng cổ Sapa tạo vật liệu vô trùng, những đốt thân này đƣợc khử trùng đƣợc thực hiện trong box, lắc trong cồn 70o trong thời gian là 5 phút, sau đó sử dụng dung dịch javen ở nồng độ lần lƣợt là: 5%, 7% và 10% trong thời gian 10 phút.
Thí nghiệm này cần đạt đƣợc tỉ lệ mẫu sạch sống cao và ngƣợc lại tỉ lệ mẫu nhiễm và tỉ lệ mẫu sạch chết thấp. Đây là giai đoạn quan trọng để tạo vật liệu khởi đầu để tiếp tục các bƣớc tiếp theo.
Bảng 3.1. Kết quảtạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cây hoa hồng cổSapa
Dung dịch javen Nồng độ (%) 5 7 10
Dựa vào kết quả phân tích thống kê (bảng 3.1) ta thấy: kết quả sau 2 tuần cho thấy javen có tác dụng trong việc làm sạch đốt thân và chồi của hoa hồng cổ Sapa (bảng 3.1), với nồng độ javen khác nhau cùng thực hiện trong khoảng thời gian 10 phút thì kết quả tỉ lệ mẫu nhiễm và mẫu sạch sống chênh nhau đáng kể. Tỉ lệ nhiễm khi sử dụng javen nồng độ lần lƣợt ở 5%, 7% và 10% trong khoảng thời gian 10 phút là: 71,85%, 36,03%, 58,88%.
Tỉ lệ mẫu sạch sống tăng dần từ 12,25% lên 49,67% khi tăng nồng độ javen từ 5% lên 7% trong thời gian 10 phút. Và khi tăng nồng độ javen lên 10% thì tỉ lệ mẫu sạch sống giảm xuống còn 24,44%.
Tỉ lệ mẫu nhiễm cao nhất là 71,85% khi sử dụng javen 5% và tỉ lệ mẫu nhiễm thấp nhất là 36,03% khi sử dụng javen 7% cùng với khoảng thời gian 10 phút.
Tỉ lệ mẫu sạch trong các thí nghiệm là chỉ tiêu để đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu, tỉ lệ mẫu sạch sống cao nhất ứng với công thức sử dụng javen 7% trong thời gian 10 phút và tỉ lệ mẫu sạch sống thấp nhất là 12,25% ứng với công thức sử dụng javen 5%, tỉ lệ mẫu sạch sống cao hơn là 24,44% khi sử dụng jven 10% trong cùng khoảng thời gian là 10 phút.
Nồng độ javen ảnh hƣởng rõ rệt trong việc làm sạch mẫu. Trong đó, chồi đƣợc khử trùng ở javen 7% cho tỷ lệ mẫu sạch sống cao nhất là 49,67% và tỉ lệ mẫu nhiễm thấp nhất là 36,03%, tỉ lệ mẫu sạch chết chỉ 6,89%. Khi khử trùng mẫu ở nồng độ javen cao hơn thì tỉ lệ mẫu sạch sống đƣợc khá thấp (24,44%) do nồng độ tẩy rửa cao mà mẫu không thích nghi đƣợc. Và ngƣợc lại, khi sử dụng nồng độ thấp thì tỉ lệ mẫu bị nhiễm cao (71,85%) do chƣa đủ nồng độ để làm sạch mẫu.
a b
c d
Hình 3.1:Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cây hoa hồng cổ Sapa a. Cành hoa hồng cổ Sapa
b. Mẫu lắc sạch ở javen 7% sau 2 ngày c. Mẫu xuất hiện chồi sau 3 tuần
d. Mẫu sạch sau 5 tuần
Mẫu sạch đƣợc khử trùng với javen nồng độ 7% trong 10 phút đã xuất hiện chồi sau 3 tuần (hình 3.1c). Chồi tiếp tục sinh trƣởng và phát triển (hình 3.1.d) kích thƣớc chồi và kích thƣớc lá lớn hơn. Màu sắc của lá xanh đậm.
3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây hoa hồng cổ Sapa
Các kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng công nghệ cao nhƣ nuôi cấy mô tế bào thực vật, sử dụng hợp lí chất dinh dƣỡng và ánh sáng nhân tạo điều khiển sinh trƣởng và phát triển thực vật ngoài tự nhiên [2]. Thí nghiệm này bổ sung BAP và NAA để tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây hoa hồng cổ Sapa.
Chất BAP là các hoocmon điều hòa sinh trƣởng an toàn với cây trồng thuộc nhóm Cytokinin. Cytokinin có vai trò sinh lý chính là điều hòa sự phân chia tế bào đỉnh chồi và rễ, thay đổi ƣu thế đỉnh và thúc đẩy sự sinh trƣởng của chồi, thúc đẩy sự vận chuyển dinh dƣỡng vào mô [2].
Chất NAA là hoocmon thuộc nhóm Auxin có vài trò kích thích sự kéo dài thân (chỉ với nồng độ thấp), tăng cƣờng ƣu thế đỉnh, các chức năng trong phản ứng hƣớng quang và hƣớng trọng lực, thúc đẩy sự phân hóa mô mạch [2].
Thí nghiệm này sử dụng BAP và NAA để tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây hoa hồng cổ Sapa: những mẫu sạch sau khi đƣợc khử trùng đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy MS bổ sung 3,5 g/l agar và 30 g/l saccharose kết hợp với BAP và NAA theo tỉ lệ khác nhau. Sau 5 tuần nuôi cấy thì nhận thấy
ở các môi trƣờng đều có sự tái sinh và nhân nhanh chồi. Dựa vào kết quả của bảng 3.2 kết hợp với hình 3.2 có thể nhận định đƣợc BAA và NAA có ảnh hƣởng nhất định tới việc tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây hoa hồng cổ Sapa. Khi môi trƣờng chỉ bổ sung thêm BAP thì số chồi tăng dần theo nồng độ đến một nồng độ nhất định (2 mg/l) thì số chồi giảm. Với môi trƣờng bổ sung thêm BAP 0,5 mg/l số chồi trung bình là 1,8 chồi, số chồi tăng lên là 4 chồi khi bổ sung thêm BAP 2,0 mg/l. Tuy nhiên khi kết hợp BAP với NAA thì số chồi giảm dần. Với môi trƣờng bổ sung BAP 1,0 mg/l và NAA 0,05 mg/l thì đƣợc số chồi trung bình là 2,8 chồi và giảm. Các chỉ tiêu đƣợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi cây hoa hồng cổ Sapa sau 8 tuần nuôi cấy
BAP (mg/l) 0,5 1,0 1,5 2,0 1,0 1,0 LSD 0,05
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
Các chất điều hòa sinh trƣởng BAP và NAA có sự ảnh hƣởng nhất định tới việc tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro ở cây hoa hồng cổ Sapa. Môi trƣờng có bổ sung BAP 2 mg/l kích thích sự tái sinh và tạo chồi cho ra chất lƣợng và số lƣợng chồi tốt nhất (số lƣợng 4 chồi/mẫu và chiều cao chồi là 2,5cm) và môi trƣờng bổ sung BAP 0,5 mg/l cho số chồi trung bình chỉ là 1,8 chồi, kích thƣớc chồi trung bình là 2,0 cm. Kết quả của môi trƣờng bổ sung BAP 1,5 mg/l và NAA 0,05 mg/l cũng cho ra số chồi trung
bình là 1,8 chồi, số lá trung bình trên mỗi chồi là 3,60 lá, chiều cao trung bình là 2,15 cm.
Xét tiêu chí số lƣợng lá trên mỗi chồi: ở công thức có bổ sung BAP 1,0 mg/l kết hợp NAA 0,05 mg/l (4,4 lá) cho ra số lƣợng lá cao hơn môi trƣờng BAP 2mg/l (4 lá). Công thức cho ra số lá trên mỗi chồi thấp nhất là môi trƣờng bổ sung BAP 1,0 mg/l kết hợp NAA 0,1 mg/l chỉ cho ra 2,80 lá.
Xét tiêu chí kích thƣớc chồi: môi trƣờng phù hợp nhất đối với cây hoa hồng cổ Sapa là môi trƣờng có bổ sung BAP 2,0 mg/l cho ra kích thƣớc chồi trung bình là 2,5 cm, sau đó là môi trƣờng có bổ sung thêm BAP 1,0 mg/l kết hợp NAA 0,1 mg/l và BAP 1,5 mg/l kết hợp NAA 0,05 mg/l đều có kích thƣớc chồi trung bình là 2,15 cm. Môi trƣờng có kết quả thấp nhất về kích thƣớc chồi là môi trƣờng có bổ sung BAP 1,5 mg/l chỉ cho kích thƣớc chồi là 1,75 cm.
Môi trƣờng có bổ sung thêm BAP 2 mg/l phù hợp nhất để tạo chồi và nhân nhanh in vitro hoa hồng cổ Sapa. Kết quả đạt tỉ lệ cao hơn kết quả của Bùi Thị Thu Hƣơng và đồng tác giả khi nghiên cứu tạo chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ cây hồng cổ Sapa: Kết quả phân tích thống kê cho thấy, khi bổ sung BAP và Kinitin đã làm cho mẫu có khả năng có tỷ lệ bật chồi và chiều cao của chồi hơn hẳn so với công thức đối chứng. Tỷ lệ mẫu bật chồi cao nhất (91,67%) ở CT5 (1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin), khác biệt có ý nghĩa thống kê với các công thức còn lại, các chồi thu đƣợc mập, lá xanh đậm và chiều cao nhất đạt đƣợc là 2,109 cm. Ở CT6 (1,5 mg/l BAP + 1 mg/l Kinetin), các mẫu có tỷ lệ bật chồi khá cao (86,67%), tuy nhiên, lá chồi bị biến dạng (không rõ hình lá), màu xanh lá không bình thƣờng, lá có màu đen tím ở gân và mép lá.[6]
a c b b d Hình 3.2. Chồi hoa hồng cổ Sapa sau 5 tuần nuôi cấy
a: tƣơng ứng với môi trƣờng MS + 30g đƣờng + 3,5g agar + BAP 0,5 mg/l
b: tƣơng ứng với môi trƣờng MS + 30g đƣờng + 3,5g agar + BAP 1,5 mg/l
c: tƣơng ứng với môi trƣờng MS + 30g đƣờng + 3,5g agar + BAP 2,0 mg/l
d: tƣơng ứng với môi trƣờng MS + 30g đƣờng + 3,5g agar +
Đều nhận thấy có sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi in vitro ở tất cả các môi trƣờng. Tuy nhiên, hệ số chồi và chất lƣợng chồi ở môi trƣờng là khác nhau. Đối với công thức có bổ sung thêm BAP 1,5 mg/l có số chồi trung
bình là 3,2 chồi (hình 3.2b), tuy nhiên chiều cao mỗi chồi chỉ dao động trong khoảng 1,75 cm. Đối với môi trƣờng có bổ sung thêm BAP 1,0 mg/l + NAA 0,1 mg/l thì hệ số chồi giảm, trung bình số chồi là 2,4 chồi (hình 3.2d). Môi trƣờng phù hợp nhất đối với hoa hồng cổ Sapa trong thí nghiệm này là môi trƣờng MS + 30g đƣờng + 3,5g agar + BAP 2,0 mg/l (hình 3.2b) có số chồi trung bình là 4 chồi, số lá trên mỗi chồi là 4 lá có màu xanh tƣơi và kích thƣớc chồi trung bình là 2,5 cm.
3.3. Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Nhóm hoocmon Auxin đƣợc tổng hợp chủ yếu ở mô phân sinh đỉnh chồi và lá non. Mô phân sinh đỉnh rễ cũng sản xuất auxin, mặc dù ở rễ phụ thuộc vào lƣợng auxin đỉnh chồi cung cấp cho nó. Vai trò sinh lý chính của auxin là thúc đẩy rễ bên và rễ bất định, kích thích sự kéo dài thân…[2].
NAA thuộc nhóm hoocmon Auxin hay đƣợc sử dụng trong giâm chiết ghép vì có độ bền hóa học cao tác dụng sinh trƣờng phát triển mạnh kích thích hình thành rễ giúp cây trồng sinh trƣởng và phát triển theo ý muốn của con ngƣời.
Những mẫu sạch đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy MS bổ sung 3,5 g/l agar và 30 g/l saccharose kết hợp NAA theo tỉ lệ khác nhau. Sau 2 tuần nuôi cấy thì nhận thấy ở các môi trƣờng có sự khác nhau về tỉ lệ ra rễ, số rễ của một chồi và chiều cao rễ đƣợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NAAđến khả năng hình thành rễ - tạo cây
in vitro hoàn chỉnh (sau 2 tuần nuôi cấy).
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 LSD0,05
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
Kết quả cho thấy sự ra rễ của chồi hoa hồng in vitro đƣợc cảm ứng bởi chất điều hòa NAA. Quá trình ra rễ của chồi hoa hồng cổ Sapa in vitro phụ thuộc vào NAA. Tỉ lệ ra rễ, số rễ và chiều cao rễ khác nhau với nồng độ NAA tƣơng ứng ở từng công thức.
Tỉ lệ ra rễ cao nhất là 60,00% tƣơng ứng với CT2 có NAA 0,5 (mg/l) và giảm dần khi nồng độ NAA tăng. Tỉ lệ ra rễ thấp nhất là 13,33% ứng với môi trƣờng bổ sung NAA 0,25 (mg/l)
Số rễ trung bình dao động từ 3 – 5 rễ. Cao nhất là 5,00 rễ ứng với NAA 0,5 (mg/l) và thấp nhất 3,00 rễ ứng với môi trƣờng chứa NAA 0,25 (mg/l). Ở môi trƣờng NAA 0,75 và NAA 1,00 (mg/l) số rễ lần lƣợt là: 4,25 và 3,25 (rễ)
Môi trƣờng thích hợp nhất là NAA 0,5 (mg/l) cho chiều dài rễ tốt nhất là 2,75 cm (CT2), sau đó là môi trƣờng có bổ sung thêm NAA 1,0 mg/l cho chiều dài rễ trung bình là 2,08 cm. Chiều dài rễ thấp nhất là 1,58 cm ứng với môi trƣờng bổ sung NAA 0,25 mg/l.
nhất để ra rễ - tạo cây con hoa hồng cổ Sapa in vitro hoàn chỉnh. Tại môi trƣờng này cho ra số lƣợng và chất lƣợng rễ tốt nhất. Sau 2 tuần nuôi cấy cho ra số lƣợng rễ là 5,00 và chiều dài rễ là 2,75 cm cùng với tỉ lệ ra rễ 60%.
Kết quả này tƣơng đồng với một số nghiên cứu ví dụ: Rashida và cộng sự đã nghiên cứu chồi Rosa indica đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có 0,6 mg/l IBA và 0,1 mg/l NAA sau khoảng thời gian 12 tuần thì tỷ lệ chồi ra rễ đạt 50%. Sự hình thành rễ của chồi hoa hồng còn đƣợc thử nghiệm với 2 mg/l IBA kết hợp với 2 mg/l α- NAA trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh (2005) cho hiệu quả trên 60% [6].
Hình 3.3. Rễ cây hoa hồng cổ Sapa trên môi trƣờng MS + NAA 0,25mg/l sau2 tuần nuôi cấy
Kết quả cho thấy mọi môi trƣờng thì đều có xuất hiện rễ, từ đó nhân định đƣợc NAA đã thúc đẩy quá trình hình thành và phát triển rễ hoa hồng cổ Sapa. Tuy nhiên, ở các môi trƣờng có nồng độ khác nhau thì khả năng tạo rễ
in vitro cũng khác nhau. Rễ cây hoa hồng cổ Sapa trên môi trƣờng MS + NAA 0,25mg/l sau 2 tuần nuôi cấy mập, trắng và có chiều dài 2,75 cm. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của La Việt Hồng trên đối tƣợng hoa hồng Mê Linh (Hà Nội) công thức môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l NAA thích hợp cho tạo rễ in vitro với tỷ lệ hình thành rễ cao nhất đạt 67,50% [4].
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ