3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.2.Tái sinh và nhân nhanh chồi invitro
a. Tái sinh chồi in vitro từ đốt thân
Mẫu cấy sau khi khử trùng được cho vào môi trường nuôi cấy khởi động với các môi trường có bổ sung BA với nồng độ khác nhau (0 ÷ 1,5 mg/l) nhằm tạo ra môi trường cho chồi tái sinh phát triển tốt nhất. Kết quả thu được được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi in vitro
Công thức
1
Công thức
Kết quả cho thấy khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy đặc điểm của chồi tái sinh có sự khác biệt. Khi nuôi cấy trên môi trường đối chứng (MS) cho thấy chồi ngủ phát triển chậm, sớm bị hoại tử (hình 3.2a). Các công thức có bổ sung BA có tác dụng kích thích sự phát triển của mắt ngủ (hình 3.2b, c, d). Với công thức bổ sung 0,5 mg/l BA chồi tái sinh nhỏ, lá có màu xanh nhạt, phát triển chậm. Chồi tái sinh màu xanh đậm, phát triển nhanh ở công thức có bổ sung 1,0 mg/l BA. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA lên 1,5 mg/l thì chồi tái sinh màu xanh nhạt, phát triển chậm chứng tỏ BA có tác dụng kích thích chồi ngủ phát triển tuy nhiên khi nồng độ tăng cao lại ức chế sự phát triển của chồi ngủ. Như vậy, công thức thích hợp cho sự tái sinh chồi hoa hồng in vitro là công thức MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l agar bổ sung 1 mg/l BA. Chồi mới tái sinh là nguyên liệu cho thí nghiệm tiếp theo.
Một số nhà khoa học khác cũng đã nghiên cứu khả năng tái sinh chồi hoa hồng in vitro từ đốt thân như Nguyễn Thị Phương Thảo (2015) nghiên cứu trên cây hoa hồng cơm (Rosa sericea Lindl.) công bố môi trường tối ưu cho sự bật chồi của đoạn thân hoa hồng là môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l BA kết hợp với 0,05 mg/l α- NAA. Bùi Thị Thu Hương và cs., (2017) cho rằng môi trường nền tối ưu nhất cho sự tái sinh chồi in vitro của cây hoa hồng cổ Sapa (Rosa gallica L.) là MS + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 30 g/l sucrose + 6,3 g/l agar (pH 5,8). Năm 2018, Nguyễn Ngọc Quỳnh Thơ khi nghiên cứu trên cây hoa hồng tỷ muội (Rosa chinensis Jacq. Var. minima Redh) đã đưa ra môi trường nuôi cấy tạo chồi thích hợp là môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA, 0,5 mg/l Kinetin, 0,5 mg/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose.
Hình 3.2. Kết quả tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng sau 14 ngày
a, b, c, d: đốt thân cấy trên môi trường MS0, MS0+BA 0,5, MS0+BA 1,0, MS0+BA 1,5
b. Ảnh hưởng của sucrose và agar đến quá trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro
Các chồi tái sinh đem cắt thành các đoạn dài 2 ÷ 3 cm cấy trong môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 20 ÷ 30 g/l sucrose kết hợp với 3,5 ÷ 7 g/l agar bổ sung 1 mg/l BA. Sau 5 tuần nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy chồi in vitro có các phản ứng khác nhau tại các môi trường này. Kết quả thu được ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của agar, sucrose đến quá trình nhân nhanh chồi Công thức 1 2 3 4 5 6 7 8 9 LSD 0.05
Với mỗi thí nghiệm, trong cùng 1 cột các chữ cái a,b,c… thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05.
Trong nghiên cứu này, việc bổ sung agar với nồng độ khác nhau có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của chồi tái sinh ở các chỉ tiêu số chồi/mẫu, chiều cao chồi, số lá/mẫu. Công thức MS chứa 1,0 mg/l BA, 25 g/l sucrose và 3,5 g/l agar cho kết quả nhân nhanh chồi tốt nhất, được thể hiện qua các chỉ tiêu số chồi/mẫu đạt 3,80, chiều cao chồi đạt 1,70 cm và số lá/chồi đạt 4,20. Công thức MS chứa 1,0 mg/l BA, 30 g/l sucrose và 5,0 g/l agar cho kết quả
Với công thức MS bổ sung 5 g/l agar kết hợp với 20 - 30 g/l sucrose (CT4 - 6) thì số chồi/mẫu giảm dần từ 3,0 chồi/mẫu (20 g/l sucrose) xuống còn 2,8 chồi/mẫu (25 g/l sucrose) và 2,2 chồi/mẫu (30 g/l sucrose). Đối với các công thức MS bổ sung 7 g/l agar kết hợp với 20 - 30 g/l sucrose (CT 7 - 9) thì số chồi/mẫu tăng lên từ 2,6 chồi/mẫu (20 g/l sucrose) đến 2,8 chồi/mẫu (25 g/l sucrose) và 3,4 chồi/mẫu (30 g/l sucrose) tuy nhiên chiều cao chồi và số lá/mẫu lại giảm dần với chiều cao chồi giảm từ 1,38 cm (20 g/l sucrose) xuống 1,14 cm (25 và 30 g/l sucrose), số lá/mẫu giảm từ 3,4 lá/mẫu (20 g/l sucrose) xuống còn 3,2 lá/mẫu (25 g/l sucrose) và 2,6 lá/mẫu (30 g/l sucrose) (bảng 3.3, hình 3.3).
Hình 3.3. Ảnh hưởng của agar, sucrose đến quá trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro
a-c: tương ứng với CT 1-3 (môi trường chứa lần lượt 20, 25 và 30 g/l saccarozơ + 3,5 g/l agar). d-f: tương ứng với CT 4-6 (môi trường chứa lần
lượt 20, 25 và 30 g/l saccarozơ + 5,0 g/l agar). g-i: tương ứng với CT 7-9 (môi trường chứa lần lượt 20, 25 và 30 g/l saccarozơ + 7,0 g/l agar)
Như vậy, môi trường bán lỏng (lượng agar 3,5 g/l) có thể phù hợp với giai đoạn nhân nhanh chồi của hoa hồng Nhung. Điều này có thể được giải thích do mẫu dễ dàng hấp thụ dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường bán lỏng [12].
c. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình nhân nhanh chồi hoa hồng
in vitro
Theo một số nghiên cứu, việc bổ sung than hoạt tính có tác dụng tăng sinh trưởng của mẫu hoa hồng trong nuôi cấy mô [12, 15] do đó chúng tôi đã bổ sung than hoạt tính vào môi trường nhân nhanh với nồng độ 0,1 ÷ 0,4 mg/l than hoạt tính đã cho thấy phản ứng của chồi hoa hồng khác nhau tại các công thức được thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến đến quá trình nhân nhanh
Công Môi trường MS thức 1 2 3 4 LSD 0,05
Với mỗi thí nghiệm, trong cùng 1 cột các chữ cái a,b,c… thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05.
Kết quả cho thấy khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy đã làm cho chồi hoa hồng tăng lên về chiều cao. Công thức bổ sung 0,1 mg/l than hoạt tính chiều cao đạt 1,9 cm, công thức bổ sung 0,2 mg/l than hoạt tính chiều cao đạt 2,7 cm, công thức bổ sung 0,3 mg/l than hoạt tính chiều cao đạt 1,84
BA) không bổ sung than hoạt tính (1,7 cm) (bảng 3.3, bảng 3.4). Trong đó ở công thức bổ sung 0,2 mg/l than hoạt tính) cho chiều cao chồi lớn nhất (đạt 2,70 cm), số lá đạt 5,2 lá/mẫu, công thức bổ sung 0,3 mg/l than hoạt tính cho chiều cao chồi thấp nhất là 1,84 cm, số lá đạt 4,0 lá/mẫu (bảng 3.4, hình 3.4).
Tóm lại, môi trường MS bổ sung 3,5 g/l agar, 25 g/l sucrose, 1,0 mg/l BA bổ sung 0,2 mg/l than hoạt tính là môi trường tốt nhất cho sự tăng chiều cao của chồi hoa hồng in vitro.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến đến quá trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro
3.3. Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chồi in vitro khi đã cứng cáp hơn thì được nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung 3,5 g/l agar, 25 g/l sucrose có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau (0 ÷ 1,0 mg/l) để hình thành rễ cho thấy tỷ lệ ra rễ, số rễ/chồi và chiều dài rễ ở công thức khác nhau là khác nhau. Kết quả thu được ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của NAA đến quá trình ra rễ - tạo cây hoa hồng in vitro hoàn chỉnh Công thức 1 2 3 4 5 LSD
Với mỗi thí nghiệm, trong cùng 1 cột các chữ cái a,b,c… thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05.
Hầu hết chồi hoa hồng nuôi cấy mô đều có khả năng ra rễ ở các công thức có bổ sung NAA (0,25; 0,50 và 0,75 mg/l), ngoại trừ CT 5 (NAA 1,0 mg/l), Trong đó, CT 3 cho tỷ lệ hình thành rễ cao nhất, đạt 67,50%; CT 2 cho số rễ/chồi tốt nhất; đạt 4,62; CT 4 cho chiều dài rễ tốt nhất; đạt 4,75 (hình 3.5 bảng 3.5).
Theo nghiên cứu của một số nhà khoa học khác như Naphaporn Nak- Udom và cs., (2009) cho thấy môi trường thích hợp cho sự ra rễ hoa hồng Rosa hybrid L. cv. “Perfume Delight” là ¼ MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho tỷ lệ hình thành rễ là 70,05%. Trong nghiên cứu của Bùi Thị Thu Hương và cs., (2017), cho rằng môi trường ¼ MS cũng là môi trường thích hợp
tỷ lệ ra rễ đạt 98,89% sau 6 tuần nuôi cấy. Theo Nguyễn Thị Kim Thanh (2005), sự hình thành rễ hoa hồng đạt hiệu quả tốt nhất ở môi trường chứa 2 mg/l NAA hoặc 2 mg/l IBA cho tỷ lệ ra rễ trên 60%.
Như vậy, môi trường thích hợp cho sự ra rễ của cây hoa hồng Nhung là ½ MS, agar 3,5 g/l, 25 g/l đường saccarozơ và NAA 0,5 mg/l.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của NAA đến quá trình ra rễ - tạo cây hoa hồng in vitro hoàn chỉnh
a. Ra rễ ở CT 2 (NAA 0,25), b. Ra rễ ở CT 3 (NAA 0, 50), c. Ra rễ ở CT 4 (NAA 0,75)
3.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi điều kiện tự nhiên
Trong nghiên cứu này, cây in vitro được trồng lên các giá thể khác nhau, che đậy bằng túi nilon (hình 3.5a), sau 7 ngày bắt đầu mở dần túi nilon cho cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên.
Kết quả cho thấy tỷ lệ cây sống sót sau 14 ngày rèn luyện lần lượt đạt 66,2; 60,0 và 75,5 (%) tương ứng với giá thể đất + trấu hun (1:1), đất phù sa và giá thể TS1 (hình 3.5 b, c, d). Đồng thời cây in vitro ở giá thể TS1 có màu xanh đậm, phát triển nhanh, ở giá thể đất + trấu hun (1:1) cây có màu xanh nhạt, phát triển chậm, còi cọc, ở giá thể đất phù sa cây có màu xanh nhạt hơn, phát triển chậm.
Ở mỗi giống hồng khác nhau, tỷ lệ sống sót cho giai đoạn rèn luyện trong từng giá thể là khác nhau. Cụ thể theo kết quả nghiên cứu của Saklani
Kumud và cs., (2015), giá thể rèn luyện chứa cát và đất vườn với tỷ lệ 1:1 cho thấy tỷ lệ sống sót của chồi hoa hồng in vitro là cao nhất đạt 60%.
Như vậy, giá thể TS1 là giá thể phù hợp cho sự rèn luyện cây hoa hồng Nhung in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên.
Hình 3.6. Rèn luyện cây hoa hồng cấy mô thích nghi với điều kiện tự nhiên
a, b, c: lần lượt là cây được rèn luyện trên giá thể đất+trấu hun (1:1), đất phù sa, giá thể TS1
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Chất khử trùng thích hợp cho đốt thân cây hoa hồng Nhung là khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 10 phút, xử lý tiếp trong dung dịch javen 5% trong 5 phút cho tỷ lệ mẫu sạch sống đạt 86,95%.
- Môi trường phù hợp để tái sinh chồi in vitro từ đốt thân của cây hoa Hồng nhung là MS, 30 g/l sucrose, 7g/l agar, 1 mg/l BA, chồi tái sinh có màu xanh đậm, phát triển nhanh.
- Môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro là MS, 1,0 mg/l BA, 25 g/l sucrose và 3,5 g/l agar (pH 5,8), bổ sung 0,2 mg/l than hoạt tính thể hiện qua các chỉ tiêu số chồi/mẫu đạt 3,60; chiều cao chồi đạt 2,70 cm và số lá/chồi đạt 5,20.
- Môi trường ½ MS, 25 g/l saccarozơ và 3,5 g/l agar, bổ sung NAA (0,5 mg/l) thích hợp cho tạo rễ in vitro, tỷ lệ hình thành rễ cao nhất, đạt 67,50%.
- Cây con được trồng trên giá thể hỗn hợp TS 1 cho tỷ lệ sống sót cao nhất 75,5 (%) sau 2 tuần rèn luyện.
2. Kiến nghị
- Thực hiện nghiên cứu đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa hồng in vitro khi đưa ra ngoài vườn ươm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Việt Chương, Lâm Thị Mỹ Hương (2006), Kỹ thuật giâm, chiết, ghép hoa hồng, NXB Thành phố Hồ Chí Minh, 36 trang.
2. Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, Nguyễn Quang Thạch (2002), Cây hoa hồng và Kỹ thuật trồng, NXB Lao động và xã hội.
3. Đồng Huy Giới, Dương Thị Mến (2017), “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nuôi cấy mô hoa hồng cổ Sapa”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 5 (78): 59 – 65. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4. Bùi Thị Thu Hương, Đồng Huy Giới, Nguyễn Thị Trang, Hồ Thị Quyên (2017), “Nhân nuôi cây Hồng cổ Sapa (Rosa gallica L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô invitro”, Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 7, trang 1229 – 1235.
5. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
6. Mai Thị Ngoan (2009), “Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, phát triển của một số giống hoa Hồng (Rosa indica L.) nhập nội và ảnh hưởng của biện pháp cắt tỉa, xử lý chế phẩm đến năng suất và chất lượng hoa Hồng VR41 tại Gia Lâm – Hà Nội”, Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội,
7. Nguyễn Quang Thạch (2000), “Trồng hoa xuất khẩu ở miền Bắc, cơ hội và thách thức”, Tạp chí Khoa học và Tổ quốc, số 12.
8. Nguyễn Thị Kim Thanh (2005), “Nhân giống cây hoa hồng bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 1: 39 – 41.
9. Nguyễn Thị Phương Thảo, Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Thu Hằng, Đặng Thị Thanh Tâm, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Lâm Hải, Nguyễn Thanh Hải (2015), “Nhân nhanh và cảm ứng ra hoa invitro cây hoa hồng cơm (Rosa sericea Lindl.)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 13 (4): 606 – 613.
10. A. A. Asadi, C. Vedadi, M, Rahimi, B. Naserian (2009), “Effect of plant growth hormones on root and shoot regeneration in Rose (Morrasia) under
in vitro conditions”, Bioscience Research, 6 (1): 40 – 45.
11.Dhawan V, Bhojwani SS, (1986), Micropropagation in crop plants, Glimpses Plant Res, 7:1 – 75.
12. Kumud S, Hem1 P, Vijay R (2015), “Micropropagation of rose cultivars: biotechnological application to floriculture”, J. Environ. Res. Develop, 10 (01), 40 – 46.
13. Naphaporn Nak-Udom, Kantamaht Kanchanapoom, Kamnoon Kanchanapoom (2009), “Micropropagation from cultured nodal explants of rose (Rosa hybrida L. cv. ‘Perfume Delight’)”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 31 (6): 583 – 586.
14. Omidi M, Yadollahi A, Eftekhari M (2016), “Comparative study of Rosa damascenes Mill. And R. Gallica micro-propagation”, Biological Forum – An International Journal, 8 (1): 135 -145.
15. Pati P.K, Rath S.P, Sharma M, Sood A, Ahuja P.S (2006), In vitro
propagation of rose – a review, Biotechnology Advances, 24: 94 – 114. 16. Rashida S., Yasmin S. and Aleem R. (2003), “In vitro propagation of Rosa
Indica”, Pakistan Journal of Biological Sciences, 6 (9): 826 – 830.
17. S. K. Senapati, G. R. Rout (2008), “Study of culture conditions for improved micropropagation of hybrid rose”, Hort. Sci. (Prague), 35 (1): 27 – 34.
Tài liệu internet
18. https://www.vietnamplus.vn/ha-noi-phat-trien-thuong-hieu-hoa-hong-gan- voi-vung-dat-me-linh/291529.vnp 19. https://hoadepviet.com/cay-hoa-hong-nhung-hong-truyen-thong-cua- nguoi-viet/ 20. https://nongnghiep.vn/benh-hai-cay-hoa-hong-bien-phap-phong-tru- post62461.html 21. https://caytrongvatnuoi.com/cac-loai-hoa/san-xuat-hoa-o-viet-nam/ 22. https://caytrongvatnuoi.com/cac-loai-hoa/gia-tri-va-y-nghia-cua-hoa- hong/
PHỤ LỤC
Một số hình ảnh trong quá trình nuôi cấy
Đốt thân hoa hồng Nhung sau 4 tuần nuôi cấy
Chồi hoa hồng trên môi trường MS bổ sung 3,5 g/l agar, 25 g/l sucrose bổ sung 1 mg/l BA (pH 5,8)