3. Nội dung nghiên cứu
2.2.2 Đánh giá các cây chuyển gen bằng PCR
2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số
Các cây ngô sinh trƣởng bình thƣờng trên môi trƣờng chọn lọc (cây chuyển gen T0) đƣợc chuyển ra trồng trong nhà lƣới, sau đó tiến hành thu mẫu lá và tách DNA tổng số theo phƣơng pháp CTAB của Saghai Maroof và cộng sự [30].
Quy trình thực hiện gồm các bƣớc:
Lá của các giống ngô đƣợc cắt làm mẫu, sau đó nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 ml; thêm 0,7 ml đệm CTAB đã làm ấm ở 650C trong 10 phút. Để các ống trong bể ổn nhiệt ở điều kiện 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhƣng dứt khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả. Chuyển các ống ở bể ổn nhiệt ra để ở nhiệt độ phòng
5 phút. Thêm 0,7 ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Dùng pipetman hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm
Isopropanol theo tỉ lệ 1: 1. Sau đó xoay ống nhẹ nhàng vài phút. Để mẫu ở tủ - 200C trong 1 giờ. Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ phần dịch phía trên thu lấy tủa. Rửa tủa bằng cồn 70 % lạnh. Sau đó, thổi khô và hoà tan tủa bằng 0,5 ml TE pH 8,0. Bổ sung RNase đã đƣợc đun cách thuỷ trong 20 phút, sau đó ủ ở 370C trong 180 phút. Bổ sung hỗn hợp Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol (25: 24: 1) theo tỉ lệ 1: 1, lắc nhẹ trong 10 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút. Hút phần dịch trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm 0,5 ml dung dịch chloroform/ isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng
10 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Hút dịch nổi sang ống mới. Thêm cồn tuyệt đối lạnh theo tỉ lệ cồn: mẫu (2: 1) vào dịch nổi, bổ sung 15 μl NaCl 5 M sau đó lắc nhẹ. Ly tâm hỗn hợp 10.000 vòng/ phút trong
10 phút. Bỏ phần dịch nổi phía trên, thu tủa và rửa tủa bằng cồn 70 % lạnh. Thổi khô tủa trong 20 phút ở Laminar. Sau đó hoà tan tủa bằng TE. Giữ mẫu trong tủ 40C.
2.2.2.2 PCR kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen chuyển nạp Bt2, Ubi
DNA tổng số đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho PCR kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen Bt2, Ubi
Kiểm tra sự có mặt của gen Ubi, Bt2 trong các cây ngô chuyển gen.
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với hỗn hợp phản ứng 20 µl gồm 1 µl DNA tổng số (25 ng/µl); 13,4 µl H2O; 2,0 µl Buffer 10X PCR; 2,5 µl dNTP (1 mM); 0,5 µl mồi F (50 ng/μl); 0,5 µl mồi R (50 ng/μl); 0,1 µl enzyme Taq polymerase (5 U/μl). Điều kiện phản ứng PCR nhƣ sau: 940C trong 4 phút; 35 chu kỳ của 1 phút 940C; 1 phút 580C (gen Ubi); 1 phút 550C (gen Bt2); 2 phút 720C và bƣớc cuối cùng 720C trong 5 phút.
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.