2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu
2.2.2. Chế tạo màng CVK nạp thuốc omeprazole natri
2.2.2.1. Phương pháp đo phổ hấp thụ của thuốc omeprazole natri
- Hòa tan 2,0 mg chế phẩm trong dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT), pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi.
- Đo phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thu đƣợc ở mức bƣớc sóng 200 nm đến 400 nm.
- Dung dịch cho hai cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 275 nm (OD= 1,214) và
305 nm (OD= 2,069).
.
2.2.2.2. Phương pháp dựng đường chuẩn của omeprazole natri
Nguyên tắc: dựa vào mẫu dung dịch chuẩn (6 mẫu):
- Thuốc omeprazole natri đƣợc pha ở các nồng độ:10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%.
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV- 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của các dung dịch chuẩn đã pha ở bƣớc sóng 275
- Bằng phần mềm Excel 2013 dựng đồ thị đƣờng chuẩn, lập phƣơng trình chuẩn omeprazole natri.
Kết quả quang phổ của omeprazole natri tại bƣớc sóng 275nm ,bảng 2.2:
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch omeprazole natri ở các nồng độ
C% ( mg/ml) OD275nm
Hình 2.3. Hình ảnh phƣơng trình đƣờng chuẩn omeprazole natri dung môi NaOH 0,1M
Phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 0,2311x - 0,1817 (R2 =0,9988) Trong đó:
x:Nồng độ omeprazole natri (mg/ml)
y: Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ x. R2
: Hệ số tƣơng quan bình phƣơng
2.2.2.3. Nạp omeprazole natri vào màng CVK
Cho màng CVK vào 20ml dung dịch omeprazole natri 30mg (dung môi NaOH 0,1M) thời gian 2 giờ, ở các trƣờng hợp (bảng 2.3):
Bảng 2.3. Các thí nghiệm cần làm để tìm ra điều kiện tối ƣu nhất STT 1 2 3 4 5 6 7 8
- Xác định hàm lƣợng thuốc omeprazole natri đƣợc nạp vào màng CVK:
Sau 2h lấy màng CVK ra, xác định lƣợng thuốc màng. Để xác định lƣợng thuốc omeprazole natri
đã đƣợc hấp thụ vào trong màng CVK đã
Hiệu suất nạp thuốc vào màng CVK, công thức (1): EE (%) = x 100% (1)
Trong đó:
EE: Hiệu suất thuốc nạp vào màng (%) Qt: Lƣợng thuốc lí thuyết (mg)
Qd: Lƣợng thuốc còn lại (mg)
2.2.2.4. Phân tích thống kê
Mỗi thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần để lấy trung bình mẫu, để phân tích phƣơng sai và xác định khoảng tin cậy sử dụng phần mềm Excel 2013 qua phân tích thống kê. Dữ liệu sẽ đƣợc trình bày theo giả định trung bình, độ lệch chuẩn “MEAN ± SD”. Một số khác biệt đƣợc coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05 [14].
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo màng CVK
3.1.1 Tạo màng CVK của G. xylinus trong môi trường nước dừa già
Trong môi trƣờng nuôi cấy tĩnh trong bình tam giác với điều kiện nhiệt độ phòng, vi khuẩn G. xylinus sẽ sử dụng chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng để sinh trƣởng, phát triển. Trong ngày đầu, vi khuẩn bắt đầu làm quen với môi trƣờng, axit bắt đầu đƣợc sinh ra khiến pH môi trƣờng giảm nhẹ. Đến ngày thứ 2, vi khuẩn bắt đầu sản sinh ra một lớp màng CVK trên bề mặt môi trƣờng với màu trắng đục và còn lẫn nhiều tạp chất, kích thƣớc của lớp màng này sẽ dày dần lên cho đến khi môi trƣờng hết chất dinh dƣỡng thì vi khuẩn ngừng sinh trƣởng, sau 7 – 10 ngày nuôi cấy tĩnh kích thƣớc của màng có độ dày 0,5 – 1cm, độ dày màng có thể khác nhau tùy thuộc vào thời gian nuôi cấy (Hình 3.1):
Màng CVK đƣợc nuôi cấy tĩnh trong môi trƣờng nƣớc dừa già( ngày thứ 10), hình 3.2:
Hình 3.2. Hình ảnh màng CVK khi nuôi cấy tĩnh ở ngày thứ 10
3.1.2. Thu màng CVK thô từ môi trường
Màng CVK đƣợc nuôi cấy tĩnh trong môi trƣờng nƣớc dừa già có màu trắng ngà, dẻo dai, có bề mặt phẳng trơn và chứa nhiều nƣớc . Ở thời điểm thu màng CVK khác nhau, kích thƣớc của màng sẽ có độ dày mỏng khác nhau. Độ dày màng là 0,5cm khi thu màng nuôi cấy ở ngày thứ 5.Và độ dày màng sẽ là 1cm khi thu màng nuôi cấy ở ngày thứ 10.Các chất dinh dƣỡng có trong môi trƣờng nuôi cấy sẽ đƣợc vi khuẩn G.xylinus sử dụng cho sự sinh trƣởng, phát triển liên tục, chúng sẽ sản sinh ra CVK và tích lũy dần trên bề mặt môi trƣờng, tạo thành một lớp màng CVK. Vậy nên kích thƣớc của màng sẽ càng dày lên khi thời gian nuôi cấy càng lâu,
cho tới khi các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt, lúc này vi khuẩn G. xylinus không sinh trƣởng nữa, độ dày màng sẽ ngừng tăng.
Hình 3.3. Hình ảnh màng CVK thu ở ngày nuôi cấy thứ 10
3.1.3. Tạo màng CVK tinh khiết
Để thu đƣợc màng CVK tinh khiết, sau khi thu màng, tiến hành đục theo khuôn, xử lý màng CVK thô.
Màng CVK tinh khiết đạt tiêu chuẩn: có độ mềm mại, linh hoạt, rất dễ để gấp mà không cần thêm một vật liệu dẻo nàovà độ bền kéo cũng nhƣ độ đàn hồi tốt, hình 3.4:
* Thí nghiệm kiểm tra độ tinh sạch của màng, hình 3.5:
Hình 3.5. Hình ảnh kết quả thử sự hiện diện của đƣờng glucose
Mẫu số 1: kích thƣớc màng dày 0,5cm. Mẫu số 2: kích thƣớc màng dày 1cm.
3.2. Khảo sát khả năng hấp thụ thuốc omeprazole natri của màngcellulose vi khuẩn cellulose vi khuẩn
Sau khi khảo sát, nồng độ thu đƣợc 30mg/ml. -Thực hiện thí nghiệm:
+Dùng cân phân tích, cân 0,6g thuốc omeprazole natri
+ Đổ vào bình tam giác 100ml
+ Cho vào bình tam giác đã có thuốc 20ml dung dịch NaOH
+ Tiến hành rung siêu âm ở mức thời gian 15 phút, nhiệt độ là 40oC
+ Sau khi rung siêu âm xong, sẽ đi lắc ở máy lắc với 100v/p trong thời gian 2h, hình 3.6:
Hình 3.6. Hình ảnh màng CVK đang hấp thụ thuốc
+ Lấy màng CVK ra khỏi dung dịch sau 2 giờ lắc, tiến hành đo trên máy UV- 2450 với OD275nm
+ Ở mức nhiệt độ 50oC , 120v/p ta làm tƣơng tự.
Bảng 3.1. Giá trị trung bình của 3 lần đo đƣợc của màng dừa hấp thụ thuốc omeprazole natri
Độ dày STT màng (cm) 1 2 3 4
- Để tính đƣợc nồng độ omeprazole natri (C%) trong dung dịch và đồng thời xác định đƣợc khối lƣợng omeprazole natri sau khi đã hấp thụ vào màng sau khoảng thời gian 2giờ (m2) ta có giá trị OD đã tìm ra trên bảng, thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn của omeprazole natri.
- Lấy khối lƣợng omeprazole natri trong dung dịch ban đầu (m1) trừ đi khối lƣợng thuốc còn lại trong dung dịch, thu đƣợc khối lƣợng thuốc đã hấp thụ vào màng.
- Tiếp tục lấy khối lƣợng omeprazole natri đƣợc hấp thụ vào màng CVK thay vào công thức (1), thu đƣợc hiệu suất hấp thụ của thuốc omeprazole natri vào màng CVK.
Bảng 3.2. Lƣợng thuốc hấp thụ vào các màng cellulose vi khuẩn tại thời điểm 2 giờ
Độ dày màng
0,5
1
+ Ta thấy khả năng hấp thụ thuốc của vật liệu CVK tƣơng đối tốt. Vật liệu CVK đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc dừa già hấp thụ tốt ở vật liệu CVK 0,5cm, nhiệt độ 40, chế độ lắc 100 vòng/phút trong khoảng thời gian 2 giờ.
+ Sau 2h, ở mức nhiệt độ 40, chế độ lắc 100 vòng/phút lƣợng thuốc hấp thu đƣợc vào màng dừa dày 1cm ít hơn là 5,02mg so với màng dừa có màng dày 0,5cm. Ở mức nhiệt độ 50, chế độ lắc 100 vòng /phút lƣợng thuốc hấp thu đƣợc vào màng dừa dày 1cm ít hơn 1,57mg so với màng dày 0,5cm. Tƣơng tự với mức nhiệt độ 40, 50;chế độ lắc 120 vòng/phút cũng có lƣợng thuốc hấp thu vào màng dày 1cm thấp hơn màng dày 0,5 cm.
+ Hiệu suất nạp thuốc: sau 2h ở mức nhiệt độ 40, chế độ lắc 100 vòng /phút màng dày 1cm là 65,08% thấp hơn màng dày 0,5cm là 80,7%. Ở mức nhiệt độ 50, chế dộ lắc 100 vòng/phút màng dày 1cm là 62,96% thấp hơn màng dày 0,5cm là 72,3%. Tƣơng tự với mức nhiệt độ 40, 50; chế độ lắc 120 vòng/phút cũng có hiệu suất nạp thuốc đối với màng dày 1cm thấp hơn màng dày 0,5 cm.
+ Điều này có thể giải thích là do màng dày 0,5 cm mỏng hơn màng dày 1 cm, các sợi cellulose ít hơn, liên kết lỏng lẻo hơn nên thuốc có thể hấp thụ vào màng một cách dễ dàng và nhanh hơn.
Vậy hiệu suất hấp thụ thuốc tỷ lệ thuận với khối lƣợng hấp thụ và màng càng hấp thụ đƣợc nhiều thuốc thì hiệu suất càng lớn và ngƣợc lại.
- Nhận xét:
+Điều kiện thử nghiệm tối ƣu để khối lƣợng thuốc hấp thu tốt nhất: nhiệt độ 40, chế độ lắc 100 vòng/phút, trong khoảng thời gian 2 giờ.
+ Vật liệu CVK đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc dừa già hấp thụ tốt với độ dày 0,5.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
- Tạo đƣợc màng CVK từ vi khuẩn G. xylinus trong môi trƣờng nƣớc dừa già.
- Màng CVK tinh khiết thu đƣợc sau quá trình xử lý.
- Màng CVK thu đƣợc có độ tinh khiết, độ thoáng cao, không có mùi chua, khi sấy khô ở nhiệt độ cao không bị biến tính, chất lƣợng của màng phù hợp với nhu cầu làm thí nghiệm.
- Từ việc điều chỉnh việc thu màng CVK ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau sẽ điều chỉnh đƣợc độ dày của màng. Từ đó điều chỉnh đƣợc lƣợng thuốc omeprazole natri hấp thụ qua màng CVK. Trong cùng điều kiện nhiệt độ, chế độ lắc và trong cùng khoảng thời gian 2 giờ màng có độ dày 1 cm có khả năng hấp thụ thuốc thấp hơn màng có độ dày 0,5 cm.
- Tìm đƣợc điều kiện tối ƣu để cho thuốc omeprazole natri hấp thụ vào vật liệu CVK: nhiệt độ 40, chế độ lắc 100 vòng/phút trong khoảng thời gian 2 giờ.
Kiến nghị
- Tiếp tục khảo sát khả năng hấp thụ của thuốc omeprazole natri của màng CVK nuôi cấy trong một số môi trƣờng: môi trƣờng chuẩn, môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Nghiên cứu giúp giảm chi phí trong quá trình tạo màng CVK từ việc nghiên cứu cải tiến môi trƣờng nuôi G. xylinus bằng các thành phần rẻ tiền.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Thị Hồng. Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus chế tạp màng sinh học
(BC). Luận án thạc sỹ Sinh học ĐHSP Hà Nội, 2007
2. Nguyễn Thị Nguyệt. Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum
cho màng Bacterial Cellulose làm mặt nạ dƣỡng da. Luận án thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2008
3. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thuỳ Vân, Trần Nhƣ Quỳnh (2012) , “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ (50), trang 453 - 462.
4. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Hoàng Thị Thảo (2011),
“Nghiêncứu vi khuẩn Acetorbacter xylinum sinh tổng hợp màng Bacterial celluloseứng dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Y học thảm họa và bỏng, ISSN 1859 - 3461(2), 122 - 127.
5. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng”, Tạp chí Dược học số 361/2006, trang 18-20.
6. Nguyễn Văn Thanh, nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum ĐH y dƣợc TP.HCM năm 2006
7. Phan Thị Huyền Vy, Bùi Minh Thy, Phùng Thị Kim Huệ,
Nguyễn
Xuân Thành, Triệu Nguyên Trung (2018) “Tối ƣu hóa hiệu suất nạp thuốc famotidin của vật liệu cellulose vi khuẩn lên men từ dịch trà
xanh theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt và mô hình Box-Behnken”, Tạp chí dƣợc học (501), trang 3.
Tài liệu tiếng Anh
8. Almeida, I.F., et al. Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin conpatibility study. Eur J Pharm Biopharm.2013, in press.
9. Amin MCIM, Ahmad N, et al.(2012), “Bacterial cellulose film coating as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties”, Sain Malaysiana,41(5), 561-8.
10. Arisawa T, Shibata T, et at.(2006), “Effects of sucralfate, cimetidine and rabeprazole on mucosalhydroxyproline content in healing of ethanol-hcl- induced gastric lesions”. Pharmacol
Physion, 33(7):628-
32. 10
11. Brown.E.Bacterial cellulose/Themoplastic polymer nanocomposites. Master of sience in chemical engineering. Washington state university, 2007.
12.Hestrin, S.; Schramm, M. (1954). "Synthesis of cellulose by
Acetobacter xylinum: II. Preparation of freeze – dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose". Biochem.J. 58 (2): 345–352
13. Nguyen TX. et al. (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J. Mater. Chem. B, 2, 7149 – 7159
14. Pinto R. J. B. et al. (2009), “Antibacterial activity of nanocomposites of silver and bacterial or vegetable cellulosic fibers”, Acta Biomater, 5, 2279 - 2289.
15. United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, National Nutrient Database for Standard Reference