enzym XO in vitro của dược liệu
3.1.1.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric
Để lựa chọn được nồng độ enzym và nồng độ cơ chất xanthin thích hợp nhất mà tại đó lượng acid uric tạo thành lớn và phù hợp nhất, thí nghiệm được tiến hành với các dung dịch có hoạt độ enzym khác nhau. Kết quả được biểu diễn ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric lên sự hình thành acid uric
Nồng độ Xanthin (X) (mM) Nồng độ Enzym XO (O) (U/mL)
0 (O1) 0,025 (O2) 0,05 (O3) 0,1 (O4) 0,2 (O5) 75 (X1) 0 65,63 ± 2,12 72,15 ± 1,96 75,46 ± 1,84 85,32 ± 2,03 150 (X2) 0 82,17 ± 1,34 86,46 ± 1,67 91,17 ± 1,85 96,28 ± 1,94 250 (X3) 0 83,24 ± 2,01 87,17 ± 1,89 93,15 ± 1,95 96,34 ± 1,85 500 (X4) 0 85,13 ± 2,34 87,24 ± 2,22 94,06 ± 1,87 97,05 ± 1,95
32
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên hiệu suất phản ứng.
Nhận xét:
Từ kết quả Bảng 3.1 và Hình 3.1, ta nhận thấy rằng, khi nồng độ xanthin không đổi, nồng độ enzym XO càng cao thì hiệu suất phản ứng càng tăng. Ở nồng độ enzym 0,025 U/mL, nồng độ xanthin 75 mM hiệu suất của phản ứng đạt 65,63 ± 2,12 %, khi tăng nồng độ enzym XO lên 0,2 U/mL và nồng độ xanthin không đổi thì hiệu suất của phản ứng tăng, đạt hiệu suất cao nhất với hiệu suất là 85,32 ± 2,03 %. Cũng thay đổi nồng độ enzym XO lần lượt là 0,025 U/mL, 0,05 U/mL, 0,1 U/mL, 0,2 U/mL và nồng độ xanthin không đổi ở 150 mM thu được hiệu suất phản ứng tăng dần là 82,17 ± 1,34 %; 86,46 ± 1,67 %; 91,17 ± 1,85 %; 96,28 ± 1,94 %. Ở nồng độ xanthin không đổi 250 mM, thay đổi nồng độ enzym là 0,025 U/mL, 0,05 U/mL, 0,1 U/mL, 0,2 U/mL cũng thu được hiệu suất phản ứng tăng dần 83,24 ± 2,01 %; 87,17 ± 1,89 %; 93,15 ± 1,95 %; 96,34 ± 1,85 %. Nồng độ xanthin là 500 mM, nồng độ enzym là 0,025 U/mL thu được hiệu suất phản ứng 85,13 ± 2,34 %, tăng nồng độ enzym lên 0,2 U/mL và vẫn giữ nồng độ xanthin ở 500 mM thì hiệu suất phản ứng đạt cao nhất 97,05 ± 1,95 %. Kết quả trên cho thấy, hiệu suất phản ứng phụ thuộc vào nồng độ enzym XO, nồng độ enzym XO tăng thì hiệu suất phản ứng cũng tăng.
Nồng độ xanthin cũng ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, khi nồng độ xanthin càng tăng thì hiệu suất phản ứng cũng tăng. Ở nồng độ xanthin là 75 Mm, nồng độ enzym là 0,025 U/mL thì hiệu suất phản ứng đạt được là 65,63
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Nồng độ xanthin 75 mM Nồng độ xanthin 150 mM Nồng độ xanthin 250 mM Nồng độ xanthin 500 mM Nồng độ enzym XO (U/ mL) Hiệu suất phản ứng
33
± 2,12 %. Giữ nguyên nồng độ enzym là 0,025 U/mL, thay đổi các nồng độ xanthin lần lượt là 150 mM, 250 mM, 500mM hiệu suất phản ứng cũng tăng dần đạt 82,17 ± 1,34 %; 83,24 ± 2,01 %; 85,13 ± 2,34 %. Khi nồng độ enzym là 0,05 U/mL, giữ nguyên nồng độ enzym và tăng nồng độ xanthin tăng dần lần lượt là 75 mM, 150 mM, 250 mM, 500mM hiệu suất phản ứng cũng tăng dần đạt 72,15 ± 1,96 %; 86,46 ± 1,67 %; 87,17 ± 1,89 %; 87,24 ± 2,22 %. Cũng thay đổi nồng độ xanthin thành các nồng độ 75 mM, 150 mM, 250 mM, 500mM, và đo ở nồng độ enzym 0,1 U/mL hiệu suất của phản ứng cũng tăng dần tỉ lệ thuận với độ đậm đặc xanthin là 75,46 ± 1,84 %; 91,17 ± 1,85 %; 93,15 ± 1,95 %; 94,06 ± 1,87 %. Ở nồng độ enzym 0,2 U/mL và nồng độ xanthin 75 mM hiệu suất của phản ứng là 85,32 ± 2,03 %, khi thay đổi nồng độ xanthin thành 150 mM, 250 mM, 500 mM và nồng độ enzym vẫn giữ nguyên 0,2 U/mL hiệu suất của phản ứng tăng dần được kết quả lần lượt là 96,28 ± 1,94 %; 96,34 ± 1,85 %; 97,05 ± 1,95 %. Kết quả trên cho thấy, khi nồng độ enzym không đổi, nồng độ xanthin tăng dần thì hiệu suất của phản ứng cũng tăng dần. Nồng độ enzym không đổi, nồng độ xanthin tăng từ 75 mM lên 150 mM có khoảng tăng hiệu suất lớn nhất, thay đổi nồng độ xanthin lên 250 mM, 500 mM hiệu suất phản ứng có mức độ tăng không đáng kể.
Dựa vào kết quả trên, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã chọn nồng độ enzym là 0,2 U/mL và nồng độ xanthin là 150 mM cho các thí nghiệm trong mô hình nghiên cứu.
3.1.1.2. Kết quả thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của Allopurinol
Allopurinol là một chất có tác dụng ức chế enzym XO in vitro và in vivo đã và đang được sử dụng trong lâm sàng.Trong nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro đã sử dụng Allopurinol làm chất đối chứng. Để thẩm định phương pháp đánh giá tác dụng ức chế hoạt động enzym XO in vitro của dược liệu bằng phương pháp đo quang, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng của chất này. Kết quả được biểu diễn ở Bảng 3.2 và Hình 3.2:
34
Bảng 3.2. Khả năng ức chế enzym XO in vitro của Allopurinol
Nồng độ (µg/mL) Phần trăm ức chế (I%) 0,5 12,5 1,25 24,4 2,5 41,5 5 66,7 10 92,6 12,5 98,9
Hình 3.2. Khả năng ức chế enzym XO in vitro của Allopurinol
Nhận xét:
Từ Bảng 3.2 và Hình 3.2: Allopurinol thể hiện khả năng ức chế enzym XO phụ thuộc vào nồng độ, ở các nồng độ khác nhau thể hiện sự ức chế rõ rệt hoạt động của enzym XO, nồng độ càng lên cao, khả năng ức chế càng lớn. Nồng độ Allopurinol 0,5 µg/mL hiệu suất ức chế chỉ đạt 12,5 %, nhưng khi tăng nồng độ Allopurinol lên lần lượt là 1,25 µg/mL, 2,5 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL hiệu suất ức chế cũng tăng đạt kết quả lần lượt là 24,4 %, 41,5 %, 66,7%,92,6 %. Tại nồng độ 12,5 µg/mL khả năng ức chế đạt 98,9 %.
35
Theo kết quả trên đồ thị, tác dụng ức chế enzym XO in vitro của Allopurinol thể hiện qua giá trị IC50 là 3,37 ± 0,24 µg/mL.
3.1.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của cây Nở ngày đất
3.1.2.1. Kết quả định tính flavonoid của dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất
Định tính flavonoid trong dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết.
Kết quả định tính flavonoid trong dịch chiết dược liệu được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả định tính flavonoid trong dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của cây Nở ngày đất.
Phân đoạn
Phản ứng
EtOH n-hexan EtOAc n-BuOH
Phản ứng Cyanidin + + + + ++ +++ Phản ứng với kiềm + + + + + +++ Phản ứng với FeCl3 + + + + + +++ Phản ứng diazo hóa + _ + ++
Ghi chú: (+) phản ứng dương tính. (-) phản ứng âm tính. Nhận xét:
Từ kết quả định tính ở Bảng 3.3 cho thấy trong cây Nở ngày đất có chứa thành phần flavonoid. Trong đó, flavonoid có trong dịch chiết n-BuOH cho các phản ứng định tính dương tính rõ nhất sau đó là dịch chiết ethanol toàn phần và dịch chiết EtOAc. Dịch chiết n-hexan cho phản ứng định tính flavonoid không rõ ràng.
36
3.1.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất
Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất lên hoạt độ enzym XO in vitro .
Giá trị phần trăm ức chế I (%) của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết ở nồng độ khác nhau từ cây Nở ngày được trình bày ở Bảng 3.4 và Hình 3.3.
Bảng 3.4. Khả năng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết cây Nở ngày đất ở các nồng độ khác nhau
Nồng độ (µg/mL) Phân đoạn I (%) IC50 (µg/m L) 5 µg/mL 10 µg/mL µg/mL 25 50 µg/mL 100 µg/mL Chứng 0 0 0 0 0 - EtOH 8,69 ± 0,67 15,85 ± 1,15 30,24 ± 1,32 51,05 ± 0,94 78,66 ± 1,12 47,37 ± 0,26 n-Hexan 4,24 ± 0,94 10,35 ± 0,61 23,75 ± 0,73 36,75 ± 0,87 56,23 ± 1.02 81,59 ± 0,21 EtOAc 12,77 ± 0,86 20,54 ± 0,76 39,55 ± 0,92 62,51 ± 1,21 86,57 ± 0,93 33,36 ± 0,51 n-BuOH 12,47 ± 1,17 25,57 ± 1,29 45,68 ± 1,03 68,37 ± 1,11 88,56 ± 0,74 27,39 ± 0,31
37
Hình 3.3. Khả năng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất ở các nồng độ khác nhau
Nhận xét:
Từ kết quả ở Bảng 3.4 và Hình 3.3, cho thấy tác dụng ức chế XO của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất tăng dần theo nồng độ. Dịch chiết ethanol toàn phần từ cây Nở ngày đất thể hiện tác dụng ức chế enzym XO in vitro với giá trị IC50 tính được là 47,37 ± 0,26 µg/mL. Trong các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất, phân đoạn n- BuOH thể hiện tác dụng ức chế enzym XO in vitro mạnh nhất với I% ở nồng độ cao nhất 100 µg/mL là 88,56 ± 0,74 %, giá trị IC50 tính được là 27,93 ± 0,31 µg/mL. Tiếp theo là phân đoạn EtOAc với giá trị I% đạt 86,57 ± 0,93 % ở nồng độ cao nhất 100 µg/mL, giá trị IC50 tính được là 33,36 ± 0,51 µg/mL. Phân đoạn n-hexan thể hiện tác dụng ức chế enzym XO in vitro yếu với giá trị IC50 tính được là 81,59 ± 0,2 µg/mL. Song song với các mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương Allopurinol cho thấy tác dụng ức chế enzym XO in vitro của Allopurinol thể hiện qua giá trị IC50 là 3,37 ± 0,24 µg/mL (Hình 3.2).
38
3.2. Bàn luận
3.2.1. Về nghiên cứu triển khai mô hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dược liệu
3.2.1.1. Về khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric
Xu hướng nghiên cứu về tác dụng ức chế enzym XO của dược liệu đang ngày càng phát triển, trên thế giới cũng có nhiều phương pháp đánh giá hoạt độ enzym XO cũng như phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym XO, phương pháp đo quang dựa trên định việc lượng acid uric là phương pháp phổ biến nhất hiện nay [52][44].Trong nước, đã có một số nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế enzym XO sử dụng phương pháp này, một vài nghiên cứu áp dụng đo quang trên hệ thống ELISA, cũng có nghiên cứu đã áp dụng đo quang trên cuvet [5][9]. Để hoàn thiện hơn mô hình đánh giá tác dụng ức chế enzym XO bằng phương pháp đo quang dựa trên việc định lượng acid uric sử dụng cuvet, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành đề tài với nội dung đánh giá tác dụng ức chế enzym XO bằng phương pháp đo quang dựa trên việc định lượng acid uric sử dụng cuvet.
Trong quá trình bảo quản, chúng tôi luôn giữ enzym XO ở nhiệt độ bảo quản là 4oC. Tuy nhiên, trong quá trình pha và tiến hành thí nghiệm, enzym có thể bị hoạt hóa và giảm hoạt độ. Vì thế, giảm thiểu tối đa tình trạng này, trong quá trình pha và quá trình làm thí nghiệm cốc đựng enzym sau khi thao tác đều được ngâm trong nước đá để đảm bảo ở nhiệt độ thấp. Enzym và cả cơ chất đều được pha ngay trước khi dùng.
Trong mô hình của chúng tôi, chúng tôi đã tiến hành khảo sát động học enzym XO vì vậy sau khi khảo sát đã lựa chọn enzym ở nồng độ 0,2 U/mL và xanthin ở nồng độ 150 mM cho các thí nghiệm tiếp theo của mô hình, vì ở những nồng độ này enzym hoạt động xúc tác tốt, hiệu suất phản ứng tạo acid uric cao.
3.2.1.2. Về thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của Allopurinol
Allopurinol là một thuốc đã được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng để điều trị tăng gút, có tác dụng hạ acid uric máu thông qua cơ chế ức chế hoạt động của enzym XO, nó thường được sử dụng làm chất đối chứng trong các thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO. Trong phương pháp này, Allopurinol đã thể hiện ức chế enzym XO rõ rệt với giá trị IC50 là 3,37 ± 0,24 µg/mL. Gía trị này tương đối sát với những khảo sát đã được tiến hành trước đây, vì vậy có thể dùng để đối chứng trực tiếp với các giá trị ức chế IC50 của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của cây thuốc.[5][9][52]
39
3.2.2. Về nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của cây Nở ngày đất
3.2.2.1. Về định tính flavonoid của dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất
Nghiên cứu này đã chỉ ra sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất thông qua kết quả định tính các phản ứng hóa học đặc trưng để xác định sự có mặt của flavonoid. Có thể nhận ra rằng, hàm lượng flavonoid tương đối cao trong dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất, đặc biệt flavonoid được xác định có mặt ở nồng độ cao nhất trong phân đoạn n-BuOH do thể hiện phản ứng mãnh liệt nhất trong các phản ứng hóa học đặc trưng đã tiến hành thí nghiệm. Đã có nghiên cứu chỉ ra rằng, flavonoid có mặt rộng rãi trong nhiều thực phẩm đồ uống có nguồn gốc thực vật [31]. Một số flavonoid được biết đến như các chất chống oxy hóa mạnh bởi chúng đã thể hiện hoạt tính oxy hóa các gốc tự do và ion hóa ion kim loại [19][22]. Ngoài hoạt tính chống oxy hóa, đã có báo cáo chỉ ra flavonoid còn có tác dụng ức chế enzym khác nhau như cyclooxygenase và lipoxygenase [27]. Một số flavonoid được chứng minh đã thể hiện tác dụng ức chế trên enzym XO sản xuất hydrogen peroxide và anion superoxide trong quá trình oxy hóa hypoxanthin thành xanthin, sau đó xanthin thành acid uric [41][43].
Các nghiên cứu về sự ức chế hoạt động của enzym XO in vitro đã cho thấy một số chất có tác dụng ức chế enzym này như p-aminophenol ở dạng oxy hoá, pyrogallol, bromoacetophenone, 6-pteridylaldehyde và hydroxymethylpterin 6 . Việc kiểm tra cấu trúc của các hợp chất này cho thấy rằng chúng có đặc điểm chung là giữ các nhóm hydroxyl hoặc carbonyl. Trong nghiên cứu của mình, Beiler và Martin đã chỉ ra các hợp chất của flavonoid, giàu các nhóm hydroxyl và có khả năng tạo thành các hợp chất quinonoid trong các hệ thống sinh học, có tác dụng như chất ức chế xanthin oxidase. Hoạt tính của enzym XO đã bị ức chế bởi một nhóm flavonoid và các hợp chất có liên quan.[57] Các flavonoid có cấu trúc phẳng và liên kết đôi C2=C3 hoạt động ức chế enzym XO mạnh hơn so với các flavonoid bị methyl hóa hay hydroxyl hóa. [58]
3.2.2.2. Về đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất
Khả năng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ cây Nở ngày đất được xác định dựa vào giá trị IC50. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra rằng dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn n-hexan, phân đoạn EtOAc, phân đoạn n-BuOH từ cây Nở ngày đất thể hiện tác dụng ức chế enzym XO in vitro với IC50 lần lượt là 47,37 ± 0,26 µg/mL; 81,59 ± 0,2 µg/mL; 33,36 ± 0,5 µg/mL; 27,93 ± 0,3
40
µg/mL. Điều này chứng tỏ, trong cao chiết ethanol và các phân đoạn cao chiết