Thẩm định phương pháp phân tích - (Luận văn thạc s- 123docz.net

3.2.1. Tính đặc hiệu của phương pháp

Tiến hành phân tích 4 mẫu: Dung dịch Atractylenolid III chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn và dung dịch mẫu trắng với điều kiện phân tích HPLC đã trình bày ở trên, thu được kết quả đánh giá bằng sắc ký đồ tương ứng như hình 4.

Hình 4: Sắc ký đồ HPLC đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trong đó: 1-

Kết quả và nhận xét: Trên sắc ký đồ thu được cho thấy, thời gian lưu của 3 mẫu

Atractylenolid III ở mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn là tương ứng với nhau và trên mẫu trắng không có. Pic Atractylenolid III không bị trùng với các pic khác. Phương pháp đã được xây dựng phù hợp với chất Atractylenolide III cần phân tích.

3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Chúng tôi tiến hành chạy nền với điều kiện đã xây dựng ở trên. Dựa vào diện tích pic chất nền, chúng tôi tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn đến khi S/N= 2-3 thì pha loãng thêm một lần nữa nếu S/N không nằm trong khoảng giới hạn trên thì giá trị đó là giá trị giới hạn phát hiện LOD, từ đó suy ra giới hạn định lượng LOQ.

Kết quả và nhận xét: Tại nồng độ 0.065 µg/ml tỷ lệ S/N tương ứng là 5. Từ đó

chúng tôi suy ra kết quả LOD với tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N=3 thì giá trị LOD =

0,039µg/ml. Kết quả thu được như sau:

- Giới hạn phát hiện (LOD): 0,039 (µg/ml).

- Giới hạn định lượng (LOQ): 0,117 (µg/ml).

3.2.3. Độ tuyến tính

Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn Atractylenolide III có nồng độ từ

104µg/ml đến 1,625µg/ml với các điều kiện như đã xây dựng ở trên. Kết quả khảo

sát giữa nồng độ và diện tích pic của dung dịch Atractylenolide tương ướng trong bảng 6.

Hình 5: Sắc ký đồ HPLC của

Atractylenolide III với nồng độ lần lượt là

Bảng 6: Kết quả độ tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng Atractylenolide

III với dãy nồng độ chuẩn.

Nồng độ (g/ml) Diện tích pic (mAU.s) Nồng độ tính lại từ đường

chuẩn (g/ml) 1.625 120783 2,487 3.25 243363 3,824 6.5 587771 7,580 13 1111158 13,287 19.5 1643712 19,095 26 2188350 25,034 32.5 2797135 31,673 52 4468481 49,899 104 9566241 105,490 Phương trình đường y= 91701x – 107362 R2 0,9987

Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu

Kết quả và nhận xét: Độ tuyến tính được đánh giá qua hệ số tương quan R2. R2 =

0,9987 cho thấy đường chuẩn có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lượng Atractylenolide III.

3.2.4. Tính thích hợp của hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống được thực hiện sắc ký tiêm 5 lần với một mẫu chuẩn

nồng độ 26µg/ml. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị độ lệch tương đối RSD

(%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 5 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu

chuẩn Atractylenolide III có nồng độ 26 µg/ml. Kết quả được trình bày dưới bảng7.

Bảng 7: Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng

Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml.

STT Diện tích pic ( mAU.s) Thời gian lưu ( phút )

1 2611305 23,169 2 2572585 23,152 3 2604363 23,363 4 2626525 23,398 5 2687905 23,445 Trung bình 2620537 23,305 RSD (%) 1,621 0,582

Kết quả và nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian

lưu đều nhỏ hơn 2%, kết quả cho thấy tính thích hợp của phương pháp đã xây dựng đạt.

3.2.5. Độ lặp lại

Độ lặp lại được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên. Độ lặp lại được đánh giá thông qua chỉ sô độ chệch tương đối (RSD) của hàm lượng dược chất trong dược liệu 2%. Kết quả thu được trình bày trong bảng 8.

Bảng 8: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng Atractylenolide

III với mẫu bạch truật chiết với Ethanol 96%.

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5

Khối lượng dược liệu (g) 0,2019 0,1975 0,1532 0,1989 0,1512

Hàm lượng Atractynolide III (%) 0,0822 0,0800 0,0789 0,0805 0,0808

TB hàm lượng (%) 0,0836

RSD (%) 1,2691

Kết quả và nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 2% cho thấy phương pháp

xây dựng có độ lặp lại cao.

3.2.6. Độ đúng

Độ đúng được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên. Độ đúng được đánh giá qua độ thu đồ dược chất cần phân tích Atractylenolide III là 98-102% theo quy định của ICH và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 3 lần lặp lại mẫu đánh giá độ

thu hồi  2%. Kết quả được trình bày dưới bảng 9.

Bảng 9: Kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng trong mẫu thử

thêm chuẩn Atractylenolide III.

Nồng độ dược chất Nồng độ thêm chuẩn Nồng độ thêm mẫu chuẩn Nồng độ dược

chất thu hồi Độ thu hồi RSD

(g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/ml) (%) (%) 24,2 19,5 44,080 19,8801 101,95 0,20 44,097 19,8970 102,04 44,021 19,8209 101,65 23,9 47,711 23,5112 98,37 1,79 47,974 23,7744 99,48

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23 49,027 24,3452 101,86 29,39 54,204 29,9667 101,96 0,19 54,084 29,8840 101,68 54,067 29,8671 101,62

Kết quả và nhận xét: Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng

Atractylenolide III trong dược liệu bạch truật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đạt trong khoảng 98-102%, chứng tỏ phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao.

3.3. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất trong củ bạch truật

Phân tích hàm lượng Atractylenolide III trên 3 mẫu dược liệu Việt Nam và Trung Quốc bằng phương pháp đã xây dựng. Kết quả được trình bày trong bảng 10 và so sánh sắc ký đồ hai mẫu bạch truật Việt Nam truật và Trung Quốc dưới hình 8.

Bảng 10: Kết quả xác định hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu bạch truật Việt

Nam và Trung Quốc.

Mẫu Tên Mẫu Hàm lượng Atractylenolide III(%)

Mẫu Việt Nam M1 0,0628

Hình 7: Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật bằng HPLC-

DAD trong đó A- Bạch truật Việt Nam, B- Bạch truật Trung Quốc.

Hình 8: Phổ hấp thụ UV của thành phần khác trong mẫu bạch truật Việt Nam.

Nhận xét: Dựa vào kết quả cho thấy trong bạch truật trồng tại Việt Nam và Trung

Quốc có hàm lượng Atractynolide III lần lượt là 0,06 và 0,08%, tương ứng. So sánh phổ đồ, trong bạch truật Việt Nam xuất hiện một số pic khác (UV trong hình 8), điều này cho thấy, bạch truật Việt Nam cần một số nghiên cứu khác về thành phần hóa học. Điều này lý giải tại sao áp dụng điều kiện chạy dược điển Hồng Kông lại thất bại trên mẫu dược liệu Việt Nam.

A B

CHƯƠNG 4- BÀN LUẬN

Trong nghiên cứu này, phương pháp định lượng Atractylenolide III trong thân rễ cây bạch truật được xây dựng và thẩm định. Trong đó, điều kiện pha động

HPLC-DAD là MeOH :H2O có tỷ lệ 43 :57. Độ chính xác của phương pháp đạt sau

khi thẩm định theo hướng dẫn của ICH.

Kết quả áp dụng phương pháp vừa xây dựng cho thấy Atractynolide III trong mẫu trồng tại Việt Nam thấp hơn Trung Quốc. Do mẫu thu thập bị giới hạn số lượng, vẫn cần nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để khẳng định chắc chắn sự khác biệt. Tuy nhiên, giá trị thu được cao hơn nhiều lần yêu cầu của dược điển Hồng Kông yêu cầu là 0,019%. Chứng tỏ, bạch truật thu hái tại Việt Nam có đủ điều kiện thâm nhập thị trường dược liệu Hồng Kông, nơi cửa ngõ giao thương bên ngoài vào Trung Quốc cũng như đi nhiều nơi khác trên thế giới.

Bên cạnh đó, hai phổ đồ thu được thể hiện rõ sự khác biệt về peak phụ. Điều này cho thấy tiềm năng sinh học cũng như thành phần hóa học của cây trồng tại Việt Nam chưa được khám phá hết. Mặt khác, chính điều này gây khó khăn không thể áp dụng dược điển Hồng Kông trong phân tích mẫu Bạch truật tại Việt Nam. Phương pháp phân tích vừa xây dựng có thể áp dụng tốt cho đối tượng Dược liệu nguồn gốc từ Trung quốc.

Từ đó, chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của bạch truật tại Việt Nam. Và các nghiên cứu sau tập trung tăng số lượng mẫu để đưa ra giới hạn hàm lượng Atractynolide III trong tiêu chuẩn cơ sở của bạch truật trồng tại Việt Nam.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Điều kiện phân tích HPLC của Atractynolide III trên mẫu bạch truật như sau:

- Hệ dung môi: ACN: nước (43: 57)

- Cột sắc ký pha đảo: Supleco C-18(5µm, 250 x 4,6mm)

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

- Bước sóng cực đại: 220 nm

- Thời gian sắc ký: 30 phút

Bạch truật thu hái tại Việt Nam có hàm lương Atractynolide III là 0,06% trong khi Trung Quốc là 0,08%. Phổ đồ của Bạch Truật Việt Nam có quan sát thấy khác biệt với Trung Quốc về peak phụ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1] Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam Bạch truật IV, Nhà xuất bản Y học, pp.

693 - 694.

[2] Bộ Khoa học và công nghệ (2007), Thực vật chí Việt Nam họ Cúc tập 7, Nhà

xuất bản Khoa học và kỹ thuật, pp. 523 – 524.

[3] Trường Thụ Sinh (2012) , Trung Dươc Lâm Sàng, Nhà xuất bản Y học, pp. 314

– 316.

[4] Viện Dược Liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam Bạch truật, Nhà xuất

bản Khoa học và Kỹ thuật liệu, pp. 360 – 382.

[5] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp

trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, pp.10-59.

Tiếng Anh

[6] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the

Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4).

[7] Bo Zhu (2018), “The traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of

Atractylodes macrocephala Koidz”,Journal of ethnopharmacology.

[8] Brian A. Bidlingmeyer (1992), Practical HPLC Methodology and Applications,

Wiley Series in Engineering and Technology Management, pp. 67 – 103.

[9] Danilo Corradini (2016), Handbook of HPLC second edition, Chromatographic

science series, pp. 207 – 232.

[10] Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), Pharmacopoeia of the peoples

republic of China – English Edition(2015), Chemical Industry Press, pp. 524 – 526.

[11] Elsevier Science (2017), “Application of Atractylodes Macrocephala Koidz

Extract in Methicillin - Resistant Staphylococcus Aureus”,Procedia

engineering, 174, pp. 410 -415.

[12] George Lunn, Norman R. Schmuff (2000) - HPLC Methods for

Pharmaceutical Analysis, Wiley-Blackwell, pp. 232 – 250.

[13] Hao Kai (2012), “Study on chemical fingerprinting of crude and

processed Atractylodes macrocephala from different locations in Zhejiang

province by reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled

with hierarchical cluster analysis”, Pharmacognosy magazine, 8(32).

[14] Hildebert Wagner, Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal

Medicines: Thin-layer and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs, Springer Science & Business Media, pp. 113 - 123.

[15] Hson-Mou Chang(1986), Pharmacology and Applications of Chinese Materia

Medica, World Scientific, pp. 349 - 353.

[16] Kokane Vikrant (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences, 3(9), pp. 654 - 663.

[17] Jiaju Zhou (2003), Traditional Chinese Medicines: Molecular Structures,

Natural Sources and Applications, Wiley, pp. 235 - 242 .

[18] Joel K. Swadesh (2000), HPLC: Practical and Industrial Applications, Second

Edition CRC Press, pp. 25 - 35.

[19] Lena Ohannesian (2001), Handbook of Pharmaceutical Analysis, CRC Press,

pp. 9 – 12.

[20] Monika Waksmundzka-Ha nos, Joseph Sherma (2010), High Performance

Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis, CRC Express, pp. 3 – 12.

[21] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7), pp. 1515-1609.

[22] The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea

7th Edition vol 2, Maisonneuve, pp, 1047 – 1050.

[23] The government of Hong Kong Special Administrative region (2002), Hong

Kong Chinese Materia Medica Standards, Chinese medicine division, pp. 265 – 273.

[24] Toshihiko T Hanai (2007), HPLC: A Practical Guide, Royal Society of

Chemistry, pp. 11 – 29.

[25] United States Pharmacopoeial Convention (2010), United States

Pharmacopoeia 35th Edition, United States Pharmacopeial Convention, pp. 970 – 973.

[26] Xu, Shizao (2018), “UPLC-MS/MS of Atractylenolide I, Atractylenolide II, Atractylenolide III, and Atractyloside A in Rat Plasma after Oral

Administration of Raw and Wheat Bran-Processed Atractylodis Rhizoma”, Morecules, 23(12), pp. 3234.

[27] Weici Tang, Gerhard Eisenbrand (2013), Chinese Drugs of Plant

Origin: Chemistry, Pharmacology, and Use in Traditional and Modern Medicine, Springer Science & Business Media, pp.199 – 201