Dựa vào độ tan của dexamethason acetat là dễ tan trong methanol, ethanol và aceton, khó tan trong methylen clorid, thực tế không tan trong nước [5, 6, 20, 23]. 3.3.2. Xử lý mẫu
26
Hình 3.8. Sơ đồ xử lý mẫu
Mẫu 4.4 là hỗn hợp mẫu 4.3 và chuẩn dexamethason acetat với tỷ lệ 1:1 (nồng độ chuẩn dexamethason acetat là 10,4µg/ml).
3.3.3. Tiến hành khảo sát Chuẩn bị mẫu mỹ Chuẩn bị mẫu mỹ phẩm (mẫu thử) Cân khoảng 3g mỹ phẩm vào cốc thủy tinh 100 ml Cắn 4.1 Hòa lại cắn trong 20ml dd aceton Khuấy kỹ và đặt trên cách thủy ấm 5-10 phút, lấy ra, để nguội trong nước đá 1giờ, sau đó lọc qua giấy lọc đã thấm ướt bằng dung môi vừa sử dụng theo mỗi cốc, bốc hơi dịch lọc trên cách thủy tới khô có sử dụng khí N2. Hòa lại cắn ở mỗi cốc trong 25ml acetonitril - nước (48:52). Lọc qua màng lọc 0,20 µm Thêm 60ml dicloromethan – methanol (9:1), khuấy kỹ và đặt trên cách thủy ấm 5- 10 phút, lấy ra, để nguội trong nước đá 1giờ, sau đó lọc qua giấy lọc đã thấm ướt bằng dicloromethan – methanol (9:1). Chia dung dịch lọc thành 3 phần bằng nhau vào 3 cốc thủy tinh 50 ml có đánh số, bốc hơi dịch lọc trên cách thủy tới khô có sử dụng khí N2 Cắn 4.2 Cắn 4.3 Hòa lại cắn trong 20ml dd methanol Hòa lại cắn trong 20ml dd ethanol
27
Mẫu 4.1
Mẫu 4.2
Mẫu 4.3
28
Hình 3.9. SKĐ của các mẫu số 4.1; 4.2; 4.3; 4.4 và mẫu chuẩn Bảng số liệu
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát mẫu 4
Mẫu Thời gian lưu (phút)
Diện tích pic
(mAU*phút) Hệ số bất đối
Chiều cao pic (mAU) Mẫu 4.1 6,433 0,5211 1,11 3,32 Mẫu 4.2 6,470 0,5046 1,09 3,40 Mẫu 4.3 6,457 0,6520 1,13 4,39 Mẫu 4.4 6,483 0,6494 1,14 4,54 Mẫu chuẩn 6,480 1,2962 1,12 9,28
- Phổ UV-VIS pic mẫu thử có thời gian lưu trùng với pic chuẩn
Mẫu chuẩn Dexamethason acetat
1 – 6,48
29
Hình 3.10. Phổ UV-VIS của pic nghi ngờ trong các mẫu số 4.1; 4.2; 4.3; 4.4
và pic chuẩn với dexamethason acetat Mẫu 4.2
Mẫu 4.3
Mẫu 4.4
30 Bảng số liệu Bảng 3.6. Kết quả phổ UV-VIS Mẫu λ max Mẫu 4.1 242,6 Mẫu 4.2 241,5 Mẫu 4.3 241,4 Mẫu 4.4 241,4 Mẫu chuẩn 240,7 Nhận xét:
Sau khi tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã bổ sung thì thu được các pic nghi ngờ rất cân đối và tách biệt. Cả ba dung môi sử dụng chiết lần hai đã loại rất tốt tạp có tR gần vời tR của dexamethason acetat. Riêng dung môi ethanol (chiết mẫu 4.3) cho kết quả pic tinh khiết và nồng độ cao nhất.
Các pic nghi ngờ của các mẫu thử có tR xấp xỉ như nhau và xấp xỉ bằng tR của pic chuẩn.
Các phổ UV-VIS đều có độ tương đồng cao với phổ chuẩn, riêng phổ của mẫu 4.1 (chiết lần 2 bằng aceton) có độ tương đồng kém hơn, mẫu 4.3 (chiết lần 2 bằng ethanol) có độ tương đồng cao nhất.
SKĐ và phổ UV-VIS của mẫu 4.4 (là hỗn hợp mẫu 4.3 và chuẩn dexamethason acetat với tỷ lệ 1:1) cho thấy tại tR của dexamethason acetat chỉ có một pic tách biệt, độ cân đối cao (hệ số bất đối 1,09) và phổ UV-VIS có độ tương đồng rất cao với phổ pic chuẩn, chứng tỏ píc rất tinh khiết.
Như vậy, những nhận xét và đánh giá trên là điều kiện cần và đủ để khẳng định mẫu số 4 có dexamethason acetat.
3.4. Bàn luận
3.4.1. Về quy trình định tính 3 chất corticoid trong kem bôi da
Dựa vào các tài liệu đã công bố, lựa chọn và tiến hành khảo sát phương pháp như phần 3.1. Kết quả đánh giá thông qua xác định tính thích hợp của hệ thống.
31 - Về phương pháp xử lý mẫu
Lựa chọn phương pháp khảo sát dựa vào các lý do: Với cách xử lý mẫu theo phương pháp, các pic thu được rất cân đối, nền mẫu phân tích sạch (hầu như không thấy xuất hiện các píc phụ), các pic tách biệt rõ ràng.
Tuy nhiên, qua việc áp dụng phương pháp đã khảo sát trên 11 mẫu mỹ phẩm thu được pic nghi ngờ có corticoid chưa tách biệt và chưa cân đối, tinh khiết. Từ đó, tiến hành xử lý các mẫu bị nghi ngờ chứa dexamethason acetat bằng cách tăng lượng mẫu lên và chiết 2 lần bằng những dung môi thích hợp. Cuối cùng, kết quả là nền mẫu sạch hơn, loại bỏ được một số pic tạp, pic nghi ngờ cân đối, có tR trùng khớp và độ trùng phổ cao với pic dexamethason acetat chuẩn.
- Về điều kiện sắc ký
Giữ nguyên điều kiện về cột sắc ký của ASEAN (cột C18 250 x 4,6 mm, 5µm). Pha động là acetonitril - nước (48:52) chế độ đẳng dòng thay cho gradient dung môi trong phương pháp.
Tiến hành chạy chế dộ đẳng dòng, đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với các phòng thí nghiệm có máy sắc ký lỏng thông dụng (không có hệ thống gradient dung môi).
- Về đánh giá quy trình phân tích
Kết quả đánh giá về độ thích hợp của hệ thống đảm bảo yêu cầu để phân tích phát hiện đồng thời các chất trong mỹ phẩm dạng kem bôi da. Phù hợp với thẩm định quy trình định tính theo ICH và USP. Khẳng định kết quả có thể tin cậy. Thực tế cho thấy để định tính đồng thời 3 chất thuộc nhóm steroid, các điều kiện về thiết bị, cột sắc ký, pha động (đặc biệt tỷ lệ thành phần pha động) phải rất ổn định. Quy trình phân tích chạy đẳng dòng đơn giản và có thể áp dụng được trên máy phân tích chỉ có một
3.4.2. Về khả năng áp dụng của quy trình
Quy trình phân tích HPLC đã khảo sát có các điều kiện xử lý mẫu, phân tích sắc ký không quá phức tạp, cột phân tích là loại phổ biến, dung môi thông dụng, không quá đắt, dễ dàng áp dụng được ở các cơ sở có máy phân tích HPLC. Tuy nhiên, đòi hỏi người làm phân tích phải được đào tạo về lý thuyết và thực hành về phương pháp HPLC, cách đọc kết quả...
32
Trong 11 mẫu mỹ phẩm thuộc dạng kem bôi da, có 1 mẫu chứa một trong 3 chất kiểm tra.
Kết quả này ít nhiều cho thấy còn có chất cấm trong mỹ phẩm, nguy cơ tiềm ẩn với sức khỏe người sử dụng từ các mặt hàng mỹ phẩm đang lưu hành tại huyện Nghi Lộc – tỉnh Nghệ An.
Con số trên mới chỉ là sơ bộ, cần làm thêm các kiểm nghiệm trên số lượng mẫu đủ lớn, diện lấy mẫu rộng hơn để có kết luận mang ý nghĩa thống kê.
3.4.4. Về những đóng góp của đề tài
- Về lựa chọn và bổ sung quy trình phân tích
Quy trình khảo sát được dựa trên quy trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam. Quá trình đã luôn bám sát các phương pháp hòa hợp sẵn có của ASEAN.
Trong quá trình thực nghiệm đã tiến hành bổ sung quy trình làm giàu và tăng độ tinh khiết mẫu để đủ điều kiện khẳng định sự có mặt của chất khảo sát.
- Về đánh giá thực trạng tình hình chất lượng mỹ phẩm
Đây là khảo sát thực tế được tiến hành để đánh giá sự có mặt của chất có tác dụng dược lý bị cấm sử dụng nhóm corticoid với 11 mẫu mỹ phẩm thuộc nhóm sản phẩm kem bôi da. Kết quả phát hiện được 1 mẫu có dexamethason acetat.
Kết quả này phần nào cho thấy thực trạng chất lượng mỹ phẩm lưu hành trên thị trường huyện Nghi Lộc – tỉnh Nghệ An cần được lưu tâm quản lý một cách sát sao hơn nữa để đảm bảo an toàn cho người sử dụng.
33
Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ kết quả thực nghiệm khóa luận đã đạt được mục tiêu đề ra, cụ thể là đã phát hiện được 1 mẫu kem mỹ phẩm có chứa dexamethason acetat và không có mẫu kem mỹ phẩm nào chứa betamethason dipropionat và prednisolon trong 11 mẫu kem mỹ phẩm thu thập tại thị trường huyện Nghi Lộc – tỉnh Nghệ An.
Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã rút ra một số nhận xét sau:
- Vì mỹ phẩm rất đa dạng về thành phần nên khó có một quy trình phân tích đồng thời nhiều chất trong mỹ phẩm có độ đặc hiệu cao cho tất cả các loại mỹ phẩm. - Khi phân tích mẫu phức tạp quy trình không đảm bảo tính đặc hiệu, cần phải lựa
chọn, bổ sung quá trình xử lý mẫu thích hợp.
KIẾN NGHỊ
- Cơ quan chức năng cần tiến hành kiểm tra thường xuyên, toàn diện mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường để đảm bảo an toàn cho người sử dụng.
- Phương pháp xử lý mẫu đã bổ sung tại đề tài cần được hoàn thiện và thẩm định để có thể áp dụng rộng rãi phân tích phát hiện chất cấm corticoid trong mỹ phẩm có nền mẫu phức tạp, góp phần quản lý tốt chất lượng mỹ phẩm.
34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2007), Hóa phân tích, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
2. Trần Tử An, Trần Tích (2007), Hóa phân tích, Tập I, II, Nhà xuất bản Y học. 3. Bộ môn Hoá dược (1993), Hóa dược, Nhà xuất bản Y học, Tr 191-237. 4. Bộ Y tế (2002), Dược Thư Quốc Gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học. 5. Bộ Y tế (2007), Hóa dược tập II, Nhà xuất bản Y học.
6. Bộ Y tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học.
7. Vương Ngọc Chính (2005), Hương liệu mỹ phẩm, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM.
8. Đào Mạnh Dũng, Lê Huy Đăng, Phạm Thị Hương Mai, Xác định corticoid trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC, Tiểu luận, Học viện Quân y.
9. Nguyễn Thị Duyên (2013), Nghiên cứu phát hiện dexamethasone trong một số chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội.
10. Trần Đức Hậu, et al. (2006), Hóa dược, Tập 2, Đại học Dược Hà Nội. 11. Lê Thị Hường Hoa (2013), Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác
định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm, Luận án tiến sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội.
12. Đặng Văn Hòa, Vĩnh Định (2012), Kiểm nghiệm thuốc (Dùng cho đào tạo dược sĩ Đại học), Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.
13. Nguyễn Thành Long (2006), Mỹ phẩm, Chuyên đề tự chọn, Đại học Dược Hà Nội.
14. Hoàng Thanh Tâm (2008), Xây dựng phương pháp phát hiện một số chất thuộc nhóm glucocorticoid trộn trái phép trong mỹ phẩm, Luận án tiến sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội.
15. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, tập II, Nhà xuất bản Y học, Tr 290-294.
16. Hải Trường, Thanh Nga, Làm thế nào để có làn da khỏe và đẹp, NXB Văn Hóa Thông Tin.
17. Hàn Chí Tú (2014), Nghiên cứu xác định hàm lượng chất cấm dexamethasone acetat trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Luận văn thạc sĩ Hóa học, Đại học Vinh.
35
18. Nguyễn Thị Xuyên, et al. (2013), "Định lượng đồng thời dexamethason acetat, betamethason, prednisolon và triamcinolon trong mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí Y - Dược học Quân sự, Số 6.
Tài liệu tiếng anh
19. ASEAN (2005), "Identification of hydrocortisone acetate, dexamethasone, betamethasone, betamethasone 17-valerate and triamcinolone acetonide in cosmetic products by TLC and HPLC".
20. Council of Europe, European Pharmacopoeia Commission (2007), The European Pharmacopoeia 6th Edition, Council Of Europe.
21. Japaneses Pharmacopoeia XIII. 22. United States Pharmacopoeia (2006).
23. The British Pharmacopoeia Commission Secretariat (2010), The British Pharmacopoeia.
24. Wu Da-nan, et al. (2008), "Determination of 8 glucocorticoids in cosmetics by ultra performance liquid chromatography",Chinese journal of health
36
PHỤ LỤC
SKĐ CỦA CÁC MẪU THỬ NGHIỆM
PL 1.1. SKĐ mẫu 1
PL 1.2. SKĐ mẫu 2
37
PL 1.4. SKĐ mẫu 4
PL 1.5. SKĐ mẫu 5
PL 1.6. SKĐ mẫu 6
38
PL 1.8. SKĐ mẫu 8
PL 1.9. SKĐ mẫu 9
PL 1.10. SKĐ mẫu 10