Phân lập chất từ rễ Phong quỳ Sa Pa - (Luận văn th- 123docz.net

Phân đoạn n-butanol từ phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa được

phân tách thô bằng sắc ký cột với silica gel pha thường, cột sắc ký được rửa sạch, lót một lớp bông mỏng dưới đáy, nhồi cột bằng phương pháp nhồi cột ướt với chất nhồi cột là silica gel pha thường, cột được ổn định từ 12-24 giờ.

Cắn phân đoạn n-butanol (100g) được hòa tan bằng MeOH, được chạy sắc ký qua cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc:MeOH:H2O theo gradient nồng độ tỷ lệ 15:1:0,3 đến MeOH 100%. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng, dồn các cột có độ đồng nhất cao, ta thu được phân đoạn PĐ13.

Phân đoạn PĐ13 (1,3g) được phân lập trên sắc ký pha đảo RP-18, rửa giải với hệ dung môi MeOH: H2O theo nồng độ MeOH tăng dần từ 70%- 90%. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng SKLM, dồn các cột có độ đồng nhất cao thu được chất PQRB1 (31mg).

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập một số hợp chất từ phân đoạn BuOH của rễ cây

Phong quỳ Sa Pa

3.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất thu đƣợc Hợp chất PQRB1

Tính chất: Bột vô định hình màu trắng. Phổ ESI-MS (m/z): 884,6 [M+Na]+

Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): xem

bảng 3. PĐ13 (1,3g) EtOAc:MeOH:H2O=15:1:0,3 MeOH 100% Ph a t hư ờng Ph a đ ảo PĐ13.1 PĐ13.2 (31mg) MeOH 70%-90% PQRB1 Cắn n-butanol (100g) 100(100g)

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU 23 Bảng 3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất PQRB Vị trí 3-O-β-D- ribopyranosyl (1→3)- α-L- rhamnopyranosyl (1→2)-α-L- arabinopyranosyl hederagenin PQRB1 δCb δCa δHa (số H, độ bội, J=Hz) HMBC (H→C) 1 39,1 39,7 1,03 (m); 1,63 (m) 2 26,3 27,5 1,73 (m); 1,82 (m) 3 81,0 80,2 3,12 (m) 4 43,5 40,2 - 5 47,6 48,3 0,73 (m) 6 18,1 18,0 1,42 (m); 1,54 (m) 7 32,7 33,4 1,62 (m); 1,74 (m) 8 39,8 40,1 - 9 48,1 48,2 1,60(m) 10 36,8 37,6 - 11 23,7 24,1 1,74 (m) 12 122,8 123,6 5,26 (1H, br s) 13 144,0 145,3 - 14 42,0 42,8 - 15 28,2 28,8 1,11 (m); 1,79 (m) 16 23,3 23,9 1,91 (m) 17 46,9 47,5 -

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU 24 18 41,6 42,5 2,88 (1H, m) 19 46,1 47,3 1,72 (m); 1,18 (m) 20 30,7 31,6 - 21 33,9 34,9 1,24 (m); 1,42 (m) 22 32,4 33,8 1,62 (m); 1,74 (m) 23 63,9 64,6 3,91(1H,m);4,02 (1H, m) 24 14,1 13,8 0,84 (3H, s) 25 16,1 16,4 1,00 (3H, s) 26 17,5 17,8 0,73 (3H, s) 27 26,0 26,5 1,20 (3H, s) 28 176,5 181,9 - 29 33,0 33,6 0,93 (3H, s) 30 23,6 24,5 0,96 (3H, s) Ara 1 104,8 104,6 4,55 (1H, d, 5) 3 2 75,4 76,4 3,54 (m) 3 75,0 74,2 3,44 (m) 4 69,6 69,6 4,11 (m) 5 66,1 66,6 3,19 (m); 3,85 (m) Rha I 1 101,3 101,6 5,24 (1H, br s) Ara-2 2 71,9 71,6 3,64 (m) 3 81,2 80,7 3,89 (m) 4 72,7 72,6 3,70 (m)

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU 25 5 69,6 70,2 3,99 (m) 6 18,4 18,8 1,29 (3H, d, 6) Rib 1 104,5 104,2 5,02 (1H, d, 4,5) Rha I-3 2 72,7 73,0 3,86 (m) 3 68,8 68,7 3,43 (m) 4 70,2 70,3 4,00 (m) 5 65,2 65,2 3,70(m); 3,89(m)

a: Đo trongCD3OD; b: Đo trong C5D5N

Hợp chất PQRB1 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Phổ khối ESI-MS có đỉnh ion tại m/z: 884,6 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tử C46H74O16.

Trên phổ 1H-NMR, 6 tín hiệu methyl singlet tại δH 0,82 (s, H-24); 1,00 (s, H-25); 0,73 (s, H-26); 1,19 (s, H-27); 0,93 (s, H-29); 0,97 (s, H-30)

Hình 3.3. Tín hiệu CH3 trên phổ DEPT

Kết hợp với 2 tín hiệu carbon olefin tại δC 123,8 (C-12) và 144,9 (C-13) và 1 tín hiệu nhóm carboxylic tại δC 178,2 (C-28) trên phổ 13C-NMR gợi ý phần aglycon của PQRB1 là bộ khung triterpenoid nhóm hederagenin.

Hình 3.4. Phổ 13C-NMR: Tín hiệu olefin và cacboxylic

Ngoài ra còn sự xuất hiện của 3 tín hiệu proton anomeric δH 1,55; 5,24;5,02 ppm; tương đương với 3 carbon anomer δC 104,6; 101,6; 104,2 cho

thấy cấu trúc của PQRB1 có 3 đơn vị đường. Đường này được nhận định là arabisone, 1 đơn vị đường rhamnose, 1 đơn vị đường ribose.

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR: 3 protons anomer hợp chất PQRB1

Vị trí gắn giữa các đường với nhau và với bộ khung olean được suy luận từ các tương quan HMBC. Tương quan H-1(Ara)/C-3, H-1(Rha I)/C- 2(Ara) và H-1(Rib)/C-3(Rha I) cho phép khẳng định vị trí liên kết phần aglycon với phần đường tại vị trí C-3 trên khung olean, 2 cầu nối đường còn lại tại vị trí C-2(Ara) và C-3(Rha I). Kết hợp tài liệu tham khảo[12], PQRB1

được xác định là 3-O–β–D–ribopyranosyl (1→3)–α-L–rhamnopyranosyl (1→2)-α–L-arabinopyranosyl hederagenin.

Hình 3.6. Công thức cấu tạo hợp chất PQRB1

3.2. Phân tích định tính hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Lựa chọn điều kiện sắc ký dựa trên các tài liệu tham khao và SKLM như sau:

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity

 Cột sắc ký: Agilent Eclipse XD B-C18 (kích thước cột 4,6 x 250mm, cỡ hạt 5µ)

 Detector UV phát bước sóng 208nm.

 Pha động: Aceton nitrin-Acid acetic 0,2%/Nước (4:1, v/v)

 Tốc độ dòng: 0,8ml/phút

 Thể tích mẫu bơm: 20µl

 Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng

Pha mẫu thử: 28mg cao dược liệu phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa hòa tan trong 1000µl methanol, siêu âm 10phút cho cao hòa tan hoàn toàn, lọc mẫu qua màng 0,45 micromet.

Tương tự làm với hợp chất PQRB1: hòa tan 2mg hợp chất PQRB1 trong 1000µl methanol, siêu âm 10 phút, lọc qua màng 0,45 micromet.

Kết quả:

 Diện tích pic của PQRB1 rất bé trong sắc ký đồ HPLC của cao n-

Butanol, hàm lượng của chất tách được tương đối nhỏ trong phần rễ cây Phong quỳ Sa Pa.

Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC của hợp chất PQRB1

Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC của cao phân đoạn n-butanol phần dưới mặt đất

cây Phong quỳ Sa Pa

3.3. Bàn luận

Quá trình phân lập hợp chất sử dụng phương pháp sắc ký: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng là phương pháp được sử dụng phổ biến do giá thành rẻ, nguyên vật liệu dễ kiếm, có thể khai triển với một lượng mẫu tương đối lớn.

Dựa trên thực nghiệm, bước đầu đã xây dựng được kiều kiện sắc ký HPLC đối với hợp chất saponin đã phân lập từ phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa.

Đề tài đã phân lập được hợp chất từ phân đoạn n-butanol của cây

Phong quỳ Sa Pa, dựa theo đặc điểm hóa lý, phương pháp phổ bao gồm phổ khối (MS), phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR) và so sánh các tài liệu tham khảo đã xác định được hợp chất PQRB1.

KẾT LUẬN

Qua quá trình thực hiện, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả sau:

Đã phân lập được hợp chất PQRB1 là 3-O–β–D–ribopyranosyl(1→3)– α-L–rhamnopyranosyl(1→2)-α–L-arabinopyranosyl hederagenin từ phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa bằng phương pháp sắc ký gồm: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

Xác định được cấu trúc của hợp chất dựa trên cơ sở dữ liệu phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và các tài liệu tham khảo. Hợp chất 3-O–β–D–ribopyranosyl(1→3)–α-L–rhamnopyranosyl(1→2)-α–L- arabinopyranosyl hederagenin lần đầu tiên phân lập được từ loài Anemone chapaensis Gagnep, bổ sung, hoàn thiên thêm về các hợp chất từ chi

Anemone.

KIẾN NGHỊ

Do thời gian nghiên cứu còn hạn hẹp, khóa luận chỉ đóng góp một phần nhỏ về phân lập hợp chất loài Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) cũng như chi Anemone. Cây phong quỳ Sa Pa hứa hẹn mang lại nhiều tiêm năng trong điều trị bênh, em xin đưa ra một số kiến nghị sau:

- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học các phân đoạn khác phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa.

- Nghiên cứu tác dụng sinh học các chất có trong cây.

- Định tính và dấu vân tay sắc ký cho các hợp chất hóa học có trong phân dưới mặt đất cũng như phân trên mặt đất cây Phong Quỳ Sa Pa.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Việt Nam

1. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ, 320.

2. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học Kỹ thuật 3. Gagnepain F. (1929), "Deux Anémones nouvelles d'Indo-Chine", Bulletin

de la Société Botanique de France. 76(2), tr. 315-316.

4. Gong WZ. (2011), "Chemical constituents and bioactivity of Anemone

cathayensis", Beijing: Minzu University of China.

5. Guan , Ying-Yu, et al. (2015), "Raddeanin A, a triterpenoid saponin

isolated from Anemone raddeana, suppresses the angiogenesis and growth of human colorectal tumor by inhibiting VEGFR2 signaling.",

Phytomedicine. 22.1, tr. 910-913.

6. Hao , Da-Cheng, Xiaojie Gu, and Peigen Xiao. (2017), "Anemone

medicinal plants: ethnopharmacology, phytochemistry and biology", Acta

Pharmaceutica Sinica B.

7. Harvard University Herbaria (2008), Flora of North America, Anemone

Genus.

8. Ji C , Cheng G, Tang H, Zhang Y, Hu Y, Zheng M, et al. (2015), "Saponin 6 of Anemone taipaiensis inhibits proliferation and induces apoptosis of U87 MG cells", Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 31(484-486).

9. Liao X , Li BG, Wang MK, Ding LS, Pan YJ, Chen YZ. (2001), "The chemical constituents from Anemone rivularis", Chem J Chin Univ. 22, tr. 1338-1341.

10. Liu , Qing, et al. (2015), "Crude triterpenoid saponins from Anemone

flaccida (Di Wu) exert anti-arthritic effects on type II collagen-induced

arthritis in rats", Chinese medicine 10.1, tr. 20.

11. Lu Jincai. et al (2009), "Structure elucidation of two trierpenoid saponins from Anemone raddeana Regel", Fitoterapia. 80, tr. 345-348.

12. Mizutani K. , Ohtani K., Wei J.-X., Kasai R., Tanaka O. (1984), "Saponins from Anemone rivularis". 34(5), tr. 327-331.

(2005), "The research on antitumor constituents of Anemone raddeana Regel", Zhong Cao Yao. 36, tr. 1775-1778.

14. Ren FZ , Chen SH, Zheng ZH, Zhang XX, Li LH, Dong AH. (2012), "Coumarins of Anemone raddeana Regel and their biological activity",

Acta Pharm Sin. 47, tr. 206-209.

15. Shao JH , Zhao CC, Liu MX. (2011), "Separation and structural

identification on the anti-tumor activity of Anemone rivularis", J Yangzhou

Univ (Nat Sci Ed) 14, tr. 48-50.

16. Shi B , Liu W, Gao L, Chen C, Hu Z, Wu W. (2012), "Chemical

composition, antibacterial and antioxidant activity of the essential oil of

Anemone rivularis", Journal Med Plant Res. 6, tr. 4221-4224.

17. Sun YX , Liu JC., Liu DY. (2011), "Phytochemicals and bioactivities of

Anemone raddeana Regel: a review", Pharmazie. 66, tr. 813-821.

18. Toki K , Saito N, Shigihara A,Honda T. (2001), "Anthocyanins from the scarlet flowers of Anemone coronaria", Phytochemistry. 56, tr. 711-715. 19. Wang B.X. , Cui J.C.,and Liu A.J. (1985), "Studies on pharmacological

action of saponin of the root of Anemone raddeana", J Tradit Chin Med 5, tr. 61-64.

20. Wang JR. , Peng SL.,Wang MK.,Feng JT.,Ding LS., (1999), "Chemical constituents of the Anemone tomentosa root", Acta Bot Sin. 41, tr. 107-109. 21. Wang M.K. , Ding L.S.,Wu F.E. (2008), "Anti-tumor activity of crude

saponin from Anemone raddeana Regel", Chin J Appl Environ Biol. 14, tr. 378-382.

22. Wang , Xiaoyang, et al. (2013), "Oleanane-type saponins from Anemone

taipaiensis and their cytotoxic activities", Fitoterapia 89, tr. 224-230.

23. Wang YZ. , Zeng G, Zhang M, Liu Y. (2014), "Chemical constituents from rhizoma of Anemone altaica.", Chin Trad Herb Drug. 45, tr. 1219- 1222.

24. Xue , Gang, et al. (2013), "Raddeanin A induces human gastric cancer cells apoptosis and inhibits their invasion in vitro", Biochemical and

the insecticidical activity and chemical components of Anemone

hupehensis L", Acta Bot Boreali-Occident Sin. 10, tr. 141-148.

26. Zhang Y , Huang XJ, Wang Y, Ye WC. (2014), "Non-saponin compounds from the rhizomes of Anemone amurensis", Food Industr. 35, tr. 99-101. 27. Zhang Y. , Yang Q E., (2014), "The identity of Anemone chappensis

(Ranunculaceae) from Vietnam", Tropical and Subtropical Botany. 22(4), tr. 335-340.

28. ZOU Zhong-Jie , DONG Yue-Sheng, YANG Jun-Shan (2005), "Chemical constituents of the Roots of Anemone altaica Fisch. ex C. A. Mey", Journal

of Integrative Plant Biology. 47 (9), tr. 1145-1147.

29. Zou ZJ. , Yang JS. (2008), "Studies on chemical constituents of rhizoma

PHỤC LỤC 1

PHỤC LỤC 2