Tác dụng và công dụng

Theo Y học cổ truyền, lá ổi có vị đắng, tính ấm, có tác dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết; quả ổi vị ngọt hơi chua sáp, tính ấm, có công dụng thu liễm, kiện vị cố tràng; các bộ phận của cây ổi thường được dùng để chữa các chứng bệnh như tả (đi lỏng), cửu lỵ (lỵ mạn tính), viêm dạ dày ruột cấp tính và mạn tính, thấp độc, thấp chẩn, sang thương xuất huyết, tiêu khát (tiểu đường), băng huyết... [5]

Beta-sitosterol trong lá ổi đã được sử dụng làm thuốc để điều trị cholesteron cao và các bệnh tim mạch. Theo FDA, các thực phẩm có chứa các este sterol thực vật như beta-sitosterol có tác dụng giảm nguy cơ mắc các bệnh mạch vành [42].

Quercetin được biết đến như một chất chống oxi hóa mạnh, chống viêm hay giúp làm giảm cholesteron[25]. Avicularin, guaijaverin có tác dụng ức chế tụ cầu [44].

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của Quercetin [25]

Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của Guaijaverin [45]

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Lá ổi tươi được thu hái vào tháng 10 năm 2018 ở Long Biên, Hà Nội. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.1.2. Chuẩn bị mẫu

Lá ổi tươi được rửa sạch, sấy khô ở 75-80°C, nghiền nhỏ. Lá khô (1,04kg) chiết với Ethanol 96% (3,24L x 3 lần) bằng phương pháp ngấm kiệt. Dịch chiết được lọc và gộp lại, cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không thu được cao Ethanol toàn phần (350g). Lấy 30g cao toàn phần phân tán trong 350 mL nước cất rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, EtOAc, BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 350mL).

2.1.3. Hóa chất và thiết bị

2.1.3.1. Hóa chất

Enzym Yeast α-glucosidase (Sigma, Singapore); p-Nitrophenyl-α-D- glucopyranoside (pNPG) (Sigma, Singapore); 4-Nitrophenol (Sigma, Singapore); p-Nitrophenyl phosphate (pNPP) (Sigma, Singapore); enzym PTP1B (Sigma, Singapore); 1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma, Singapore); Axit ursolic (Himedia, Ấn độ).

Dung môi: n – Hexan, Ethyl acetat (EtOAc), n – Buthanol (n-BuOH), Ethanol 96% (EtOH) (Shouguang, Trung Quốc) và nước cất.

2.1.3.2. Thiết bị

Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản).

Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức). Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

Dưới tác dụng của enzym α-glucosidase, cơ chất p-nitrophenyl-α-D- glucopyranosid (PNP-G) bị thủy phân tạo ra α-D-glucose và p-nitrophenol (PNP). Nồng độ p-nitrophenol sẽ thỉ lệ thuận với hoạt độ của enzym α- glucosidase. Nồng độ p-nitrophenol tạo thành trong dung dịch được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm. Dựa vào độ hấp thụ màu của mẫu thử và mẫu chứng ở 405nm để đánh giá hoạt tính của enzym α-glucosidase.

Hình 2.1. Phản ứng thủy phân PNP-G dưới tác dụng của enzym α-

glucosidase [7]

2.2.1.1. Phương pháp tiến hành

Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự [21]. Cụ thể như sau:

- Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong đệm phosphate 10 mM (pH 6.8) và 50 l được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64 g/ml; 16 g/ml; 4 g/ml.

- 20 µl α- glucosidase (0,5U/ml) và 130 µl đệm phosphate 100 mM (pH 6.8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37o

C trong 15 phút. p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) p-nitrophenol α-D-glucose HO HO O OH OH OH OH NO2 HO HO O OH OH O O2N α-glucosidase

- Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37oC trong 60 phút.

- Đĩa thí nghiệm chỉ có mẫu thử, đệm phosphate và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng (blank). Giếng thí nghiệm chỉ có DMSO 10%, đệm phosphate, enzym và pNPG được sử dụng làm đối chứng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo sự chính xác.

- Dừng thí nghiệm bằng cách thêm vào 80 µl Na2CO3 0,2M và đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad).

- Khả năng ức chế enzym α- glucosidase của mẫu thử được xác định theo công thức sau:

% ức chế = 100 - (Amẫu thử/ A đối chứng *100) Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank

Amẫu thử = ODmẫu thử - OD blank mauthu

2.2.1.2. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

2.2.2. Đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B in vitro

Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B được tiến hành ở 30°C. Dưới tác dụng của PTP1B, cơ chất p-nitrophenyl phosphate (pNPP) bị phosphoryl hóa tạo ra p-nitrophenol (PNP). Nồng độ p-nitrophenol tạo thành trong dung dịch được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm. Khi có mặt chất ức chế, nồng độ PNP sẽ giảm, dựa vào sự chênh lệch nồng độ giữa mẫu thử và mẫu chứng, có thể xác định được nồng độ enzym PTP1B [5].

2.2.2.1. Phương pháp tiến hành

Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym PTP1B được tiến hành theo phương pháp được mô tả bởi Hung và cộng sự, có thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [6].

Cơ chất là p-nitrophenyl phosphate (pNPP) được sử dụng trong thí nghiệm. Dung dịch đệm gồm có 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic axit), và 50 mM citrate (pH 6.0).

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách thêm 10 L dung dịch mẫu thử vào 20 L dung dịch enzym PTP1B (1 g/ml), và trộn đều với 40 L pNPP 4 mM trong 130 L dung dịch đệm trong đĩa 96 giếng.

Ủ ở 37oC trong vòng 30 phút, sau đó thêm 10 L NaOH 1M để dừng phản ứng. Đo lượng p-nitrophenol sinh ra bằng cách đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405 nm.

Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Axit ursolic được sử dụng làm chứng dương. Phần trăm ức chế hoạt độ enzym PTP1B (% I) được tính theo công thức:

Trong đó: I% phần trăm hoạt tính PTP1B bị ức chế

Ac : độ hấp thu của mẫu chứng (không chứa 10 µL dung dịch thử) At : độ hấp thu của mẫu thử

Ao : độ hấp thu của mẫu trắng

2.2.2.2. Xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê sử dụng phần mềm SigmaPlot 10 (Systat Software Inc, Mỹ). Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả chiết xuất và phân đoạn dịch chiết lá ổi

Lá ổi (1kg) sau khi được sấy khô, nghiền nhỏ, và chiết với Ethanol 96% thu được 350g cao toàn phần. Lấy 30g cao toàn phần thu được đem chiết phân đoạn với n-Hexan, EtOAc, n-Buthanol thu được ba loại cao phân đoạn gồm: 8,31g cao n-Hexan; 2,43g cao EtOAc; 18,12g cao n-Buthanol.

3.2. Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi được thử nghiệm tại các nồng độ 128; 32; 8; 2 µg/mL. Để tăng tính chính xác, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Acarbose được sử dụng như chất đối chứng dương. Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế enzym của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ, được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết toàn phần, các

phân đoạn dịch chiết lá ổi và Acarbose

STT Mẫu ức chế tại các nồng đ (µg/ml) Giá trị IC50 (g/ml) 128 32 8 2 1 Cao chiết tổng EtOH 98,73 97,56 96,69 45,13 2,20 2 Phân đoạn n- Hexan 90,84 90,11 81,58 42,09 2,53

3 Phân đoạn EtOAc 96,08 95,19 94,40 44,21 2,24 4 Phân đoạn BuOH 99,86 98,05 97,42 46,17 2,16

Chất đối chứng Acarbose 139,52

Bảng 3.1 tóm tắt giá trị IC50 của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết và Acarbose. Tác dụng ức chế α-glucosidase của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao toàn phần EtOH, phân đoạn n-Hexan, phân đoạn EtOAc và phân đoạn BuOH đều có tác dụng ức chế α-glucosidase cao với giá trị IC50 lần lượt là 2,20; 2,53; 2,24 và 2,16 µg/mL; so với chứng dương Acarbose có IC50 là 139,52 µg/mL. Đặc biệt, phân đoạn BuOH cho thấy khả năng ức chế khá tốt tại nồng độ 128 µg/ml (99,86%) và 32 µg/ml (98,05%). Cao chiết toàn phần cho thấy tác dụng ức chế khả quan tại 128 µg/ml (98,73%). Hai phân đoạn EtOAc và n-Hexan

có tác dụng ức chế yếu hơn tại nồng độ 128 µg/ml. (96,08% và 90,84%). Chất đối chứng dương acarbose hoạt động ổn định trong thí nghiệm.

3.3. Tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro

Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi được thử nghiệm tại các nồng độ 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 µg/mL. Để tăng tính chính xác, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Axit usolic được sử dụng như chất đối chứng dương (bảng 3.3). Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế enzym của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ, được thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao chiết toàn phần, các phân

đoạn dịch chiết lá ổi

Nồng đ (µg/mL)

Phần trăm ức chế (I%)

EtOH n-hexan EtOAc n-BuOH

1000 96,68 87.58 98.21 99.67 500 83.36 76.38 85.48 89.24 250 66.29 56.12 72,35 76,97 125 46,54 33,74 52,68 56,13 62,5 29,67 14,36 30,67 35,61 31,25 15,34 7,75 18,36 20,64 LogIC50 2,13 2,31 2,08 1,99 IC50 134,89 204,17 120,22 97,72

Bảng 3.3. Tác dụng ức chế enzym PTP1B của axit ursolic.

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của dịch

chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết lá ổi

Nồng đ (µg/mL) Phần trăm ức chế (I%) Axit ursolic 100 98,4 50 89,6 25 56,39 12,5 39,57 6,25 26,3 3,125 18,69 IC50 19,7 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 0 20 40 60 80 100 120 EtOH n-Hexane EtOAc BuOH Ứ c ch ế Log (Nồng đ ) (μg/mL)

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của axit

ursolic

Bảng 3.2 và bảng 3.3 tóm tắt giá trị IC50 của dịch chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết và axit ursolic. Tác dụng ức chế PTP1B của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ. Phân đoạn dịch chiết EtOAc và BuOH cho thấy có khả năng ức chế cao nhất với IC50 là 120,23 và 97,72 µg/mL so với chứng dương axit ursolic là 19,7 µg/mL. Phân đoạn n-Hexan có tác dụng ức chế enzym PTP1B thấp nhất với IC50 là 204,17 µg/mL. 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 0 20 40 60 80 100 120 Axit ursolic Ứ c ch ế Log (Nồng đ ) (μg/mL)

Chƣơng 4: BÀN LUẬN

Hiện nay, đái tháo đường type 2 đang trở thành một bệnh lý phổ biến nhất trên toàn thế giới, chiếm 90% tổng số tất cả các các ca mắc tiểu đường và có tỷ lệ tử vong cao. Bệnh đái tháo đường type 2 là bệnh lý chuyển hóa mạn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm trên hầu hết các cơ quan như tim, thận, mạch máu,…[41] Các biến chứng của bệnh tiểu đường có thể để lại nhiều di chứng như mù mắt hay phải cát cụt chi. Bệnh đái tháo đường type 2 và các biến chứng của nó gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến cuộc sống của người bệnh và giờ đây càng nguy hiểm hơn khi độ tuổi mắc bệnh đang dần trẻ hóa [16]. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đang nỗ lực để tìm ra những loại thuốc mới để điều trị hiệu quả bệnh đái tháo đường type 2, nhằm hạn chế các biến chứng và nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh. Các nhà khoa học hiện nay đang dần chuyển sang nghiên cứu các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược vì chúng an toàn và ít tác dụng phụ, một trong số đó là những thuốc có khả năng ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B [13, 15].

Ổi là một loại cây đã xuất hiện từ rất lâu và phổ biến trên toàn thế giới. Các bộ phận của cây ổi đều có tác dụng nhất định trong đó lá và quả ổi được sử dụng nhiều nhất. Từ xa xưa lá và quả ổi đã được sử dụng với nhiều mục địch khác nhau tại nhiều vùng miền trên thế giới cho tới nay. Quả ổi làm thực phẩm vừa có thể làm thuốc chữa bệnh. Lá ổi theo y học cổ truyền có vị đắng, tính ấm, có tác dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết [5]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp chất trong lá ổi có khả năng kháng khuẩn, chống oxi hóa, giảm cholesteron [17]. Lá ổi có tiềm năng sẽ trở thành một nguyên liệu mới trong sản xuất các thuốc có nguồn gốc tự nhiên dùng để điều trị nhiều bệnh trong đó có đái tháo đường type 2. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh được tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B của các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi, làm tiền đề cho sự nghiên cứu sâu hơn về loại lá đầy triển vọng này.

Enzym α-glusidase là enzym nằm trong màng đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa, enzym này xúc tác cho quá trình phân hủy các đường disaccaride như sucrose hay maltose thành nomosaccharide như glucose [20]. Do đó, các chất ức chế α-glusidase sẽ có vai trò quan trọng

trong điều trị bệnh tiểu đường. Acarbose, voglibose, miglitol là chất ức chế α- glusidase đã được sử dụng làm thuốc điều trị đái tháo đường type 2 nhưng các chất này để lại nhiều tác dụng không mong muốn như đau bụng , tiêu chảy,...[22]. Trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy tác dụng ức chế enzym của các phân đoạn dịch chiết lá ổi khá khả quan, đặc biệt là phân đoạn BuOH với IC50 là 2,16. Các phân đoạn còn lại cũng cho thấy khả năng ức chế khá tốt mặc dù còn nhiều tạp chất.

Đái tháo đường type 2 có liên quan tới đề kháng insulin và được dự đoán là do suy giảm các tín hiệu từ các thụ thể insulin [26]. Các nghiên cứu cho thấy PTP1B là enzym điều hòa ngược tín hiệu insulin quan trọng Để kết thúc tín hiệu, insulin cần khử phospho của phân tử IRβ và các phân tử sau đó. Enzym PTP1B tăng hoạt động hoặc được biểu hiện sẽ làm tăng quá trình khử phospho hóa IRβ và làm giảm tín hiệu insulin, và kháng insulin [27]. Vì vậy, về lý thuyết, PTP1B giảm hoạt động sẽ làm tăng độ nhạy insulin. Các hợp chất ức chế PTP1B có tiềm năng trong điều trị bệnh đái tháo đường type 2 và béo phì. Các hợp chất trong lá ổi gồm có: morin flavonoid, morin-3-O- lyxosyde, morin-3-O-arabinoside, quercetin, quercetin-3-O-arabinoside, glycosides, alkaloids, saponins và tritecpenoid [32].

Nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của cây ổi trên thế giới đã được công bố. Nghiên cứu của Haseena Banu và cộng sự cho thấy dùng theo đường uống cao chiết lá ổi với liều 300 mg/kg thể trọng có tác dụng hạ đường huyết trên chuột bị gây tiểu đường do streptozotocin. Kết quả cụ thể của nhóm nghiên cứu này cho thấy cao chiết lá ổi có tác dụng hạ glucose máu, nồng độ HbA1c và làm tăng đáng kể lượng insulin trong huyết tương, cải thiện hoạt tính của các enzym chuyển hóa carbohydrate như hexokinase, pyruvate kinase.

Một nghiên cứu khác cũng cho thấy cao chiết nước của lá ổi (250 mg/kg)

Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro