Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất

3.1.1. Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn

Lá Khôi đốm được rửa sạch, phơi khô, làm nhỏ. Cân 2,5 kg lá cây Khôi đốm đã làm nhỏ và ngâm chiết bằng 8L dung môi EtOH 80% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, rút lấy dịch chiết lần một. Bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2-3cm (8L/lần) và tiếp tục chiết thêm hai lần, thu được dịch chiết lần hai và lần ba.

Gộp dịch chiết 3 lần, lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc đem cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm thu được khoảng 150 g cao chiết tổng ethanol.

Hòa tan 100g cao đặc trong nước nóng, tỷ lệ thể tích cao đặc: nước cất nóng (1:1) thu được dịch chiết nước. Dịch chiết nước đem lắc lần lượt với các dung môi: n-hexan, ethyl acetat; mỗi dung môi được chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi trong 30 phút, thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng. Các phân đoạn dịch chiết được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 600C đến cắn thu được các cắn tương ứng n- hexan (9,2g), ethyl acetat (28,8g) và dịch nước còn lại (26,6g).

Bảng 3.1. Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết ethanol từ lá Khôi đốm

STT Phân đoạn Khối lượng cắn (g) % so với nguyên liệu khô

1 Cắn toàn phần EtOH 150 6

2 Cắn n-hexan 9,2 0,368

3 Cắn etylacetat 28,8 1,152

4 Cắn nước 26,6 1,064

Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Khôi đốm

3.1.2. Phân lập hợp chất

Lớp nước (N, 25,0 g) được triển khai trên cột sắc ký trao đổi ion với chất hấp phụ là Diaion HP-20 với hệ dung môi tăng dần nồng độ methanol trong nước (50, 75, 100%) thu được 3 phân đoạn N1 (6,8 g), N2 (8,1 g), N3 (7,3 g).

Lọc

Dược liệu (2,5 kg)

Dịch chiết ethanol

Chiết với ethanol 80% (8,0 lít x 3 lần)

Dịch chiết ethyl acetat

Cao Ethanol (150g)

Ethanol thu hồi

Nước cất Dịch chiết n-hexan ( Dịch chiết nước n-hexan Ethyl acetat Cắn ethyl acetat (28,8 g) Cắn n-hexan (9,2g) (

n-hexan thu hồi

Dịch chiết nước

Cắn nước

(26,6g)

Phân đoạn N2 (8,1 g) được hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi methanol sau đó tẩm với 25,0g silicagel, cô quay dưới áp suất thấp thu được bột mẫu. Bột này được phân tách bằng sắc ký cột silicagel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi chloroform: methanol (30:1→ 1:1; v/v) thu được 4 phân đoạn N2.1 (1,1 g), N2.2 (1,8 g), N2.3 (1,6 g), N2.4 (2,1 g). Triển khai sắc ký phân đoạn N2.1 với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi rửa giải ethanol : methanol (2:1, v/v) thu được hợp chất NX1 (16 mg). Triển khai sắc ký phân đoạn N2.2 với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi rửa giải chloroform : methanol (1:2, v/v) thu được hợp chất NX2 (15 mg). Phân đoạn N2.3 tiến hành sắc ký trên cột pha đảo kích thước 80 cm x 3 cm, hệ dung môi rửa giải methanol : nước (1:3, v/v), thu được hợp chất NX3 (16 mg).

Sơ đồ phân lập cắn nước được trình bày theo hình 3.2

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước

Cắn nước (N) N1 N2 N3 N2.1 N2.2 N2.3 N2.4 Hợp chất NX1 SKC (EtOH: MeOH 2:1) Hợp chất NX2 Hợp chất NX3 SKC (CHCl3: MeOH 1:2) SKC Diaion HP-20 (MeOH: H2O 50, 75, 100%) SKC (CHCl3: MeOH 30:1→1:1) SKC (MeOH: H2O 1:3)

3.2. Kết quả xác định cấu trúc hợp chất

3.2.1. Hợp chất NX1: 4',5,7-Trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon

Tính chất: Chất rắn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy: tnc= 291 -293 oC Rf = 0,51 (TLC, silica gel, ethylacetat : methanol : nước, 2:4:0,1; v/v/v), hiện màu đen với dung dịch sắt(III) chlorid : ethanol 5%, ESI-MS m/z 329,1 [M-H]-, 353,1 [M+Na]+, 331,0 [M+H]+, CTPT: C17H14O7.

Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất NX1 và chất tham khảo [23] được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của NX1 và chất tham khảo [23]

Vị trí C DEPT δCNX1 ppm δCVa,b ppm δHNX1 (ppm) (Mult, J=Hz) δHVa,c (ppm) (Mult, J=Hz) 2 C 164,0 163,9 - - 3 CH 103,6 103,3 6,96 (d, 2,0) 7,06 (s) 4 C 181,8 181,7 - - 5 C 161,5 161,4 - - 6 CH 98,8 98,7 6,22 (d, 2,0) 6,31 (d, 1,7) 7 C 163,7 163,6 - - 8 CH 94,1 94,2 6,56 (d, 2,0) 6,66 (d, 1,6) 9 C 157,4 161,0 - - 10 C 103,6 103,7 - - 1' C 120,5 120,4 - - 2' CH 104,4 104,6 7,31 (d, 0,5) 7,41 (s) 3' C 148,3 157,3 - - 4' C 139,9 148,1 - - 5' C 148,3 157,3 - - 6' CH 104,5 104,6 7,31 (d, 0,5) 7,41 (s) OH-5 12,94 (s) 12,95 (s) 3'-OCH3 3,88 (s) 3,98 (s) 5'-OCH3 3,88 (s) 3,98 (s)

aĐo trong CDCl3 , b125 MHz, c500 MHz của chất tham khảo [23]

Hợp chất NX1 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng. Phổ ESI-MS xuất hiện các pic ion m/z 329,1 [M-H]-, 353,1 [M+Na]+, 331,0 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C17H14O7.

Phổ 1H-NMR của NX1 cho các tín hiệu đặc trưng của một flavonoid với cặp hai tín hiệu tại H 6,22 và 6,56 đều dưới dạng doublet (J=2,0 Hz) điển hình của hai proton H-6 và H-8 của vòng A, tín hiệu singlet H 6,96 (1H, H-3) được xác định là proton thuộc vòng C. Tín hiệu singlet tương ứng với 2H tại H 7,31 cho thấy vòng B thế các vị trí C-3', C-4', C-5' và còn lại hai proton H- 2' và H-6'. Căn cứ vào tín hiệu singlet tại H 3,88 (6H, s, 2 x OCH3) có thể thấy hai nhóm methoxy này phải nối với C-3' và C-5', như vậy tại các vị trí C- 5, C-7, C-4' sẽ là các nhóm hydroxyl. Phổ 13C-NMR của NX1 cho thấy hợp chất này có 17 nguyên tử cacbon, trong đó 15 cacbon thuộc vào khung flavon và 2 cacbon còn lại là của nhóm methoxy. Tín hiệu cacbon cacbonyl tại C 181,8 cho thấy sự có mặt của nối đôi C-2/C-3. Tại các vị trí C-3', C-4' và C-5', giá trị C của C-4' thấp hơn C-3', C-5' phù hợp với sự metyl hóa nhóm hydroxyl trong phổ NMR. Tất cả các dữ kiện phổ NMR của NX1 hoàn toàn phù hợp với các dữ liệu đã công bố trong tài liệu tham khảo [24] cho phép kết luận về cấu trúc của NX1 là 4',5,7-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon.

Hình 3.3: Cấu trúc hợp chất NX1

3.2.2. Hợp chất NX2: Kaempferol-3-O--L-arabinofuranosid

Tính chất: Chất rắn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy: tnc= 224-226oC. Rf = 0,50 (TLC, silica gel, ethylacetat : acid formic : nước, 15:4:1, v:v:v), hiện màu đen với dung dịch Sắt(III) chlorid : ethanol 5%.

Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất NX2 và chất tham khảo [18] được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của NX2và chất tham khảo [18]

Vị trí C DEPT δCNX2 ppm δCXa,b ppm δHNX2 (ppm) (Mult, J=Hz) δHXa,c (ppm) (Mult, J=Hz) 2 C 159,2 158,5 - - 3 C 134,8 134,9 - - 4 C 179,9 179,8 - - 5 C 163,1 163,0 - - 6 CH 99,8 99,9 6,21 (d; 2,0) 6,17 (d; 1,8) 7 C 165,9 166,1 - - 8 CH 94,7 94,8 6,38 (d; 2,0) 6,36 (d; 1,5) 9 C 158,6 159,3 - - 10 C 105,7 105,6 - - 1' C 122,7 122,8 - - 2' CH 131,9 131,9 7,94 (d; 9,0) 7,92 (d; 8,7) 3' CH 116,6 116,5 6,91 (d; 9,0) 6,89 (d; 9,0) 4' C 161,4 161,5 - - 5' CH 116,4 116,5 6,91 (d; 9,0) 6,89 (d; 9,0) 6' CH 131,8 131,9 7,94 (d; 9,0) 7,92 (d; 8,7) 1'' 2’ 3’ 4’ 5’ CH 109,6 109,6 5,48 (br, s) 5,46 (s) 2'' CH 83,2 83,3 4,31 (br, d) 4,30 (d; 3,0) 3'' CH 78,5 78,6 3,91 (dd; 3,0; 5,0) 3,89 (dd; 3,0; 5,1) 4'' CH 87,8 87,9 3,81 (dd; 4,5; 9,0) 3,79 (dd; 4,2; 8,9) 5'' CH2 62,4 62,5 3,50 (dd; 2,0; 12,5) 3,47 (d; 4,0)

aĐo trong CDCl3 , b125 MHz, c500 MHz của chất tham khảo [18]

Hợp chất NX2 thu được dưới dạng chất rắn có màu vàng đặc trưng cho các hợp chất flavonoid. Phổ 1H-NMR của NX2 xuất hiện hai vùng tín hiệu rõ ràng, một vùng tín hiệu của các proton vòng thơm nằm ở phía trường thấp và một vùng tín hiệu của một phân tử đường ở vùng trường cao hơn. Sự có mặt của một vòng thơm thế para (vòng B) được nhận biết bởi hai tín hiệu doublet tại H 7,94 (2H, d, J=9,0 Hz; H-2' & H-6'); 6,91 (2H, d, J=9,0 Hz; H-3' & H- 5'); hai tín hiệu broad singlet tại H 6,21 và 6,38 phù hợp với hai proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A của các hợp chất flavonol. Ngoài ra, trên phổ này không thấy xuất hiện các proton olefin khác chứng tỏ rằng hợp chất flavonol này có các nhóm thế tại C-3', C-5 và C-7. Sự tương tác của các tín hiệu vùng

trường thấp này với phổ của hợp chất kaempferol cho phép khẳng định về cấu trúc kaempferol của phần aglycon trong NX2.

Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất NX2 chỉ ra nó là một dẫn xuất O- glycosid của kaempferol. Phân tử đường gồm 5 tín hiệu tại C 109,6 (C-1''); 83,2 (C-2''); 78,5 (C-3''); 87,8 (C-4''); 62,4 (C-5'') cho thấy đây là một furanose. Các giá trị C của phân tử đường này hoàn toàn trùng khớp với các giá trị tương ứng của -L-arabinofuranose đã được công bố. Với -L- arabinofuranose, ba tín hiệu dễ nhận biết nhất đó là cacbon anome và hai tín hiệu cacbon CH có độ chuyển dịch hóa học khá cao C 109,6 (C-1''), 83,2 (C- 2'') và 87,8 (C-4''). Tương tác giữa proton anome H 5,48 (H-1'') và cacbon C 134,8 (C-3) trên phổ HMBC cho phép xác định vị trí liên kết của arabinofuranose với khung kaempferol tại C-3. Tham khảo tài liệu hợp chất

NX2 [18]được nhận biết là kaempferol-3-O--L-arabinofuranosid.

Hình 3.4: Cấu trúc hợp chất NX2

3.2.3. Hợp chất NX3: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid

Tính chất: Dạng bột màu vàng nhạt, phổ APCI-MS m/z 449,1, công thức phân tử C21H20O11.

Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất NX3 và chất tham khảo [18] được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR của NX3và chất tham khảo [18]

Vị trí C DEPT δCNX3 ppm δCXa,b ppm δHNX3 (ppm) (Mult, J=Hz) δHXa,c (ppm) (Mult, J=Hz) 2 C 159,2 159,1 - - 3 C 135,6 135,5 - - 4 C 179,6 179,5 - - 5 C 163,1 163,0 - - 6 CH 100,1 99,9 6,24 (d; 2,0) 6,18 (d; 1,8) 7 C 166,3 166,0 - - 8 CH 94,7 94,8 6,41 (d; 2,0) 6,38 (d; 2,1) 9 C 158,6 158,5 - - 10 C 105,6 105,7 - - 1' C 122,7 122,8 - - 2' CH 132,4 132,3 8,08 (d; 9,0) 8,05 (d; 9,0) 3' CH 116,2 116,1 6,90 (d; 9,0) 6,87 (dd; 2,1; 8,7) 4' C 161,6 161,5 - - 5' CH 116,2 116,1 6,90 (d; 9,0) 6,87 (dd; 2,1; 8,7) 6' CH 132,4 132,3 8,08 (d; 9,0) 8,04 (d; 9,0) 1'' CH 104,1 104,1 5,25 (d;7,5) 5,23 (d;7,5) 2'' CH 75,6 75,7 3,46 (m) 3,40 (dd; 7,2; 10,0) 3'' CH 78,5 78,4 3,24 (m) 3,25-3,40 (m) 4'' CH 71,4 71,3 3,36 (m) 3,25-3,40 (m) 5'' CH 78,2 78,4 3,45 (m) 3,20 (ddd; 2,1; 5,1; 7,5) 6'' CH2 62,7 62,6 3,72 (dd; 2,0; 11,5) 3,51 (dd; 5,5; 12,0) 3,71 (dd; 2,1; 11,7) 3,51 (dd; 5,4; 11,7)

aĐo trong CD3OD , b125 MHz, c500 MHz của chất tham khảo[18]

Hợp chất NX3 phân lập được dưới dạng bột màu vàng nhạt. Trên phổ khối lượng APCI-MS của hợp chất NX3 xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 449,1 tương ứng với hợp chất có công thức phân tử C21H20O11.

Phổ 1H-NMR của NX3 xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δH 6,24 (1H, d, J=2,0Hz; H-6) và δH 6,41 (1H, d, J=2,0Hz; H-8) điển hình cho hai proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A của hợp chất flavonol. Cặp tín hiệu doublet khác tại δH 6,90 (2H, d, J=9,0Hz; H-3', H-5') và δH 8,08 (2H, d,

J=9,0Hz; H-2', H-6') đặc trong cho vòng thơm thế para. Tín hiệu proton anomer tại δH 5,25 (1H, d, J=7,5Hz; H-1'') gợi ý trong phân tử hợp chất NX3

có mặt một gốc đường.

Trên phổ 1 3C-NMR và DEPT của hợp chất NX3 xuất hiện của 21 nguyên tử carbon, trong đó có 11 nhóm methin và 1 nhóm methylen. Trong đó 6 tín hiệu tại δC 104,1; 75,6; 78,5; 71,4; 78,2 và 62,7 tương ứng với C-1'', C-2'', C-3'', C-4'', C-5'' và C-6'' khẳng định sự có mặt của nhóm glucopyranosyl và tín hiệu của 15 nguyên tử carbon thuộc vào khung flavonol có vòng B thế para. So sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất NX3 với hợp chất kaempferol-3- O-β-D-glucopyranosid [18] thấy gần như hoàn toàn phù hợp. Tương tác HMBC giữa tín hiệu proton δH 5,25 (H-1'') với tín hiệu carbon δC 135,6 (C-3) gợi ý nhóm O-β-D-glucopyranosyl gắn vào vị trí số 3. Từ các dữ liệu phổ trên, cho phép kết luận hợp chất NX3 có tên là kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid.

3.3. Bàn luận

3.3.1. Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ lá Khôi đốm

Đề tài đã chiết xuất được cao toàn phần từ lá Khôi đốm bằng phương pháp chiết lạnh: ngâm tại nhiệt độ phòng trong 3 ngày với dung môi EtOH 80%. Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền thu được khối lượng cắn toàn phần đạt 6% so với lượng dược liệu ban đầu. Cắn toàn phần sau đó được chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, ethyl acetat thu được ba phân đoạn là n-hexan, ethyl acetat và và dịch chiết nước, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 600C thu được lần lượt các cắn phân đoạn với khối lượng đạt 0,368% ; 1,152% ; 1,064% so với nguyên liệu khô ban đầu.

3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

Kết quả phân lập được 3 hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước của lá Khôi đốm thu tại tỉnh Nam Định. Cấu trúc các hợp chất này được xác định thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối, phổ cộng hưởng hạt nhân và so sánh với các dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan. Ba hợp chất được xác định là 4',5,7-Trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon (NX1), Kaempferol-3-O--L-arabinofuranosid (NX2), Kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid (NX3).

4',5,7-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon: Đây là chất lần đầu tiên được phân lập từ lá cây Khôi đốm nói riêng và chi Sanchezia nói chung, là một flavonoid được tìm thấy chủ yếu trong các loại cỏ và ngũ cốc khác nhau thuộc họ Poaceae, như lúa mì, lúa mạch, tre, yến mạch, ngô, gạo và được phát hiện với hàm lượng cao trong họ Huperziaceae [33,42]. Hợp chất này có nhiều tác dụng sinh học được biết đến như chống viêm, chống oxy hóa, chống dị ứng, chống vi rút và ức chế sự hình thành khối u [16,33] như ức chế sự phát triển của ung thư biểu mô đại trực tràng [32], ung thư vú [11]. Các cơ chế phân tử liên quan đến hợp chất ngày càng được làm rõ như 4',5,7- trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon làm giảm phản ứng viêm trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi của người (hPBMC) thông qua điều chỉnh các con đường tín hiệu TLR4/NF-κB/STAT, p38MAPK và PI3K/AKT [46,47] hay

các cơ chế liên quan đến ung thư vú và ung thư trực tràng thông qua sự ức chế các hoạt động cyclooxygenase và P-glycoprotein [12,33]. Năm 2016, Jang Mi Han và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu in vitro cho thấy tiềm năng của hợp chất này liên quan đến ức chế sự hình thành khối u thông qua việc ngăn chặn kép yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu VEGFR2 và protein HIF-1α [16]. Năm 2017, từ lá của loài Casearia arborea (Salicaceae), Augusto L. Santos và cộng sự cho thấy hợp chất có tác dụng điều trị bệnh do nhiễm ký sinh trùng Leishmania gây ra và tác dụng điều hòa miễn dịch trên tế bào chủ do kích thích đại thực bào sản xuất ra NO (oxit nitric) [42].

Kaempferol-3-O--L-arabinofuranosid: Là một flavonoid được phân lập từ một số loài thuộc họ khác nhau như Rubus rigidus var. camerunensis

họ Rosaceae [34], Polygonum aviculare họ Polygonaceae. Đây cũng là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ cây Khôi đốm cũng như chi

Sanchezia. Hợp chất này có tác dụng chống viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [54], tác dụng chống oxy hóa [34], [38], hoạt động bảo vệ thần kinh chống độc tính do glutamate gây ra trên các tế bào HT22 [50] và khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 [30]. Năm 2014, từ bộ phận trên mặt đất của loài Polygonum aviculare, Hyo Hyun Yang và cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng chống lão hóa trên nguyên bào sợi ở người (HDFs), kết quả cho thấy kaempferol-3-O--L-arabinofuranosid làm giảm β- galactosidase liên quan đến lão hóa, một dấu ấn sinh học sử dụng rộng rãi của