1.4.2.1. Kỹ thuật PCR
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotide tự do. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước như sau:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,
Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động xúc tác quá trình tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuyếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
23
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm khuôn mẫu để tổng hợp các đoạn DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là các đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài xác định là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi[8].
Hình 1.6. Nguyên lý kỹ thuật PCR Gen cầnkhuếch đại DNA mẫu Phản ứng khuếch đại 236 = 68 tỷ bản sao
4 bản sao 8 bản sao 16 bản sao 32 bản sao
1 chukỳ 2chu kỳ 3 chukỳ 35 chu kỳ Bƣớc 1: biến tính Bƣớc 2: bắt cặp Bƣớc 3: tổng hợp
24
1.4.2.2. Kỹ thuật PCR-RFLP
- Nguyên lý: PCR-RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzym cắt thích hợp. Các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethidium bromide cho ta biết được tính đa hình thái của đoạn DNA cần phân tích [11].
- Enzym cắt giới hạn:
Enzym cắt giới hạn hay còn gọi enzym hạn chế, enzym cắt là enzym dưới nhóm quan trọng của các enzym endonuclease, enzym này cắt DNA ở các vị trí xác định dựa trên sự nhận biết đoạn trình tự đặc hiệu với từng enzym thành các đoạn DNA có kích thước khác nhau. Enzym cắt giới hạn được dùng để xác định alen liên quan đến các SNP do sự thay đổi 1 nucleotid trong mỗi SNP làm thay đổi đoạn trình tự đặc hiệu nhận biết bởi enzym cắt giới hạn trên đoạn DNA đó .
Bảng 1.2. Vị trí cắt của một số enzym giới hạn
Tên enzym Nguồn vi khuẩn Trình tự nhận biết
EcoRI Eschericia coli RY13 5'-G↓AATTC-3'
EcoRII Eschericia coli R245 5'-↓CCTGG-3'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens H 5'-G↓GATCC-3'
SmaI Serratia marcesclens Sb 5'-CCC↓GGG-3'
ApaI Acetobacter pasteurianus 5'-GGGCC↓C-3'
SspI * Sphaerotilus natans 5'-AAT↓ATT-3'
Các enzym giới hạn có đặc điểm sau:
- Đều được chiết tách từ vi khuẩn, và tên của enzym giới hạn mang tên viết tắt của vi khuẩn
25
- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu (hay gọi vị trí giới hạn) cho từng loại enzym.
- Vị trí cắt thường có 4-8 Nu, đặc trưng quan trọng nhất của trình tự giới hạn là đoạn DNA gồm 4-8 cặp Nu có trình tự giống nhau khi đọc theo chiều 3-5 và 5-3. Vì vậy, vị trí cắt của enzym giống nhau trên cả 2 mạch.
- Sau khi bị cắt, DNA có các đầu kết dính ở các sợi đơn. Cùng bị cắt với cùng loại enzym giới hạn, các phân tử DNA có các đầu kết dính với các Nu bổ sung cho nhau.
Ưu điểm kỹ thuật PCR-RFLP:rẻ tiền, không đòi hỏi máy móc hiện đại. Kỹ thuật đơn giản, dễ dàng áp dụng vào nhiều các nghiên cứu, phân tích chủ yếu đa hình đơn nucleotide.
Nhược điểm: Một vài enzym cắt giới hạn có giá đắt, khó khăn trong việc thiết kế mồi đặc hiệu, và enzym cắt thích hợp để thu được sản phẩm có kích thước khác nhau giúp cho việc nhận định và phân tích kết quả. Quy trình làm thủ công nên mất nhiều thời gian. Hạn chế thấy rõ nhất là khó có thể xác định kiểu gen nếu có nhiều SNPs khác nhau trên đoạn gen bởi nó đòi hỏi nhiều cặp mồi và enzym cắt khác nhau. Hơn nữa, kiểu gen và alen có thể bị nhận định sai nếu enzym cắt sản phẩm gen khuyếch đại không hoàn toàn [11].
1.4.2.3. Kỹ thuật giải trình tự gen
Hiện nay, người ta sử dụng máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc của Sanger. Với các máy thế hệ mới sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây, hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện được là nucleotid nào, từ đó biết được trình tự của DNA đích.
26
Phương pháp giải trình tự gen cho phép phát hiện tất cả các đột biến, đặc biệt là các đột biến điểm, do đó kỹ thuật này được áp dụng cho việc phát hiện một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn của gen, đồng thời cũng được sử dụng như một phương pháp đối chứng để kiểm tra độ chính xác, độ đặc hiệu của phương pháp PCR-RFLP [47], [31], [50].
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Hứa thị Ngọc Hà., Lê Minh Huy., Nguyễn Sào Trung (2010), "Đặc điểm giải phẫu bệnh trong carcinôm tế bào gan", Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh,14(4), pp. 160-165.
2. Lê Minh Huy., Hứa thị Ngọc Hà., Nguyễn Sào Trung (2010), "Đặc điểm giải phẫu bệnh trong carcinôm tế bào gan", Y học TP Hồ Chí Minh,14(4), pp. 160 – 165.
3. Trần Văn Huy (2003), Nghiên cứu dấu ấn của các virus viêm gan B, C và đặc điểm cận lâm sàng ung thư biểu mô tế bào gan, Luận án Tiến sĩ, Đại học Huế, Huế.
4. Đào Văn Long (2012), "Ung thư biểu mô tế bào gan", Bài giảng nội khoa tập II, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
5. Hà Văn Mạo., Hoàng Kỷ., Phạm Hoàng Phiệt (2006), Ung thư gan nguyên phát, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.
6. Nguyễn Cường Thịnh., Lê Văn Thành (2009), "Phẫu thuật cắt gan điều trị ung thư tế bào gan", Tạp chí Y học TP.HCM,13(6), pp. 547-555.
7. Nguyễn Sào Trung., Nguyễn Quang Tuấn., Nguyễn Văn Thắng (2004), "Ung thư gan nguyên phát: Đặcđiểm giải phẫu bệnh-lâm sàng", Tạp chí Y học TP.HCM, (8), pp. 4.
8. Tạ Thành Văn (2010), PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.
Tiếng anh
9. Vijay A.R (2013), Genetics of Alcohol Metabolism, Springer New York. 10. Eddie K. Abdalla., Emile Brihi., Hady Ghanem (2015), "Liver", UICC
11. Henrik B.R (2012), "Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-AmplifiedFragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis - Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting", Gel Electrophoresis - Principles and Basics,18, pp. 315-320.
12. Bradford B.U (2005), "Cytochrome P450 CYP2E1, but not nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, is required for ethanol-induced oxidative DNA damage in rodent liver", Hepatology,41(2), pp. 336–344. 13. Jordi Bruix., Morris Sherman (2011), "AASLD PRACTICE GUIDELINE:
Management of Hepatocellular Carcinoma: An Update", Hepatology,53(3), pp. 1020-1022.
14. Wang C., Zhao T., Shen L (2015), "Clinical significance of ALDH2 rs671 polymorphism in esophageal cancer: evidence from 31 case-control studies",
Onco Targets Ther,8, pp. 649-659.
15. Chen C.C, Lu R.B, Chen Y.C, et al.(1999), "Interaction between the functional polymorphisms of the alcohol-metabolism genes in protection against alcoholism", American Journal of Human Genetics,65(3), pp. 795– 807.
16. Steinmetz C.G., Xie P., Weiner H., et al.(1997), "Structure of mitochondrial aldehyde dehydrogenase: the genetic component of ethanol aversion",
Structure,5, pp. 701-711.
17. Ehlers C.L, Spence J.P, Wall T.L, et al.(2004), "Association of ALDH1 promoter polymorphisms with alcohol-related phenotypes in southwest California Indians", Alcoholism: Clinical and Experimental Research,28(10), pp. 1481–1486.
18. De Zio D., Cecconi F., Filomeni G (2015), "Oxidative stress and autophagy: the clash between damage and metabolic needs", Cell Death and Differentiation,22, pp. 377–388.
19. Gong D., Ding G., Gu H (2012), "A variant allele of ADH1B and ALDH2, is associated with the risk of esophageal cancer", Exp Ther Med,4(1), pp. 135-140.
20. Wu D., Cederbaum A.I (2003), "Alcohol, oxidative stress, and free radical damage", Alcohol Res Health,27(4), pp. 277-284.
21. Tuma D.J., Casey C.A (2003), "Dangerous byproducts of alcohol breakdown: Focus on adducts", Alcohol Research & Health,27(4), pp. 285–290.
22. Agarwal D.P., Goedde H.W (1987), "Human aldehyde dehydrogenase isozymes and alcohol sensitivity", Isozymes Curr Top Biol Med Res,16, pp. 21-48.
23. Crabb D.W, Edenberg H.J, Bosron W.F, et al. (1989), "Genotypes for aldehyde dehydroge nase deficiency and alcohol sensitivity: The inactive ALDH2(2) allele is dominant", Journal of Clinical Investigation,83(1), pp. 314-316.
24. Luke O. Dannenberg (2006), Transcriptional regulation of the human class I alcohol dehydrogenase genes, ProQuest Information and Learning Company, Nooth Zeeb.
25. H J Edenberg., W F Bosron (2010), "Acohol dehydrogenases",
Comprehensive Toxicology, Elsevier Ltd, UK, pp. 111-126.
26. ESMO (2012), "Hepatocellular Carcinoma: ESMO-ESDO Clinical Practice Guidelines", Ann Oncol,23(Suppl 7), pp. 41-48.
27. de Paula Careta F., Paneto G.G (2012), "Recent patents on high-throughput single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping methods", Recent Pat DNA Gene Seq,6(2), pp. 122-126.
28. Stickel F (2002), "Cocarcinogenic effects of alcohol in hepatocarcinogenesis", Gut,51(1), pp. 132–139.
29. Turati F., Galeone C., Rota M., et al.(2014), "Alcohol and liver cancer: a systematic review and meta-analysis of prospective studies", Ann Oncol,25(8), pp. 1526-1535.
30. Lauwers G.Y, Terris B, Balis U.J, et al. (2002), "Prognostic histologic indicators of curativelyresected hepatocellular carcinoma", American Journal of surgical Pathology,26(1), pp. 25-34.
31. Miodrag Guvi (2013), "The history of DNA sequencing", J Med Biochem,32(4), pp. 301- 312.
32. Oota H, Pakstis A.J, Bonne-Tamir B, et al.(2004), "The evolution and population genetics of the ALDH2 locus: Random genetic drift, selection, and low levels of recombination", Annals of Human Genetics,68(2), pp. 93-109. 33. Yuzugullu H, Gursoy-Yuzugullu O, Yilmaz M, et al. (2011), "Aflatoxin
genotoxicity is associated with a defective DNA damage response bypassing p53 activation", Liver Int,31(4), pp. 561-571.
34. Seitz H.K., Stickel F (2010), "Alcetaldehyde as an underestimated risk factor for cancer development: role of genetics in ethanol metabolism", Genes Nutr,5(2), pp. 121-128.
35. Seitz H.K., Becker P (2007), "Alcohol Metabolism and Cancer Risk",
Alcohol Research & Health,30(1), pp. 38-47.
36. Luo H.R, Israel Y, Tu G.C, et al.(2005), "Genetic polymorphism of aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) in a Chinese population: gender, age, culture, and genotypes of ALDH2.", Biochem Genet,43(5-6), pp. 223-227.
37. Gray I.C., Campbell D.A., Spurr N.K (2000), "Single nucleotide polymorphisms as tools in human genetics", Hum Mol Genet,9(16), pp. 2403- 2408.
38. McKillop I.H., Schrum L.W (2009), "Role of Alcohol inLiver Carcinogenesis", Semin Liver Dis,29(2), pp. 222-232.
39. IARC (2012), Globocan 2012: Liver cancer Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012.
40. Theravathu J.A, Jaruga P, Nath R.G, et al.(2005), "Polyamines stimulate the formation of mutagenic1,N2propanodeoxyguanosinase adducts from acetaldehyde", Nucleic Acids Res,33(11), pp. 3513–3520.
41. Howard J.E (2007), "The Genetics of Alcohol Metabolism, Role of Alcohol Dehydrogenase and Aldehyde Dehydrogenase Variants,"Alcohol Reseach Health,30(1), pp. 5-12.
42. Spence J.P, Liang T, Eriksson C.J, et al.(2003), "Evaluation of aldehyde dehydrogenase 1 promoter polymorphisms identified in human populations",
Alcoholism: Clinical and Experimental Research,27(9), pp. 1389–1394. 43. Zhang J.Y, Dai M, Wang X, et al. (1998), "A case-control study of hepatitis
B and C virus infection as risk for hepatocellular carcinoma in Henan, China", Internationl Journal of Epidemiology,27, pp. 574-578.
44. Tanaka K, Sakai H, Hashizume M, et al. (2000), "Serum testosterone:estradiol ratio and the development of hepatocellular carcinoma among male cirrhotic patients", Cancer Res,60(18), pp. 5106-5110.
45. Bordone L (2005), "Calorie restriction, SIRT1 and metabolism: Understanding longevity", Nature,6(4), pp. 298–305.
46. Harty L.C, Caporaso N.E, Hayes R.B, et al. (1997), "Alcohol dehydrogenase 3 genotype and risk of oral cavity and pharyngeal cancers", J Natl Cancer Inst,89(22), pp. 1698–1705.
47. França L.T., Carrilho E., Kist T.B (2002), "A review of DNA sequencing techniques", Quarterly Reviews of Biophysics,35(2), pp. 169-200.
48. Kubo M (2015), "Clinical Practice Guidelines for Hepatocellular Carcinoma Differ between Japan, United States, and Europe", Liver Cancer,4(2), pp. 85- 95.
49. Liu M., Jiang L., Guan X.Y (2014), "The genetic and epigenetic alterations in human hepatocellular carcinoma: a recent update", Protein Cell,5, pp. 673-691.
50. Anjana Munshi (2012), DNA Sequencing - Methods and Applications, InTech, Croatia.
51. Hansell N.K, Pang D, Heath A.C, et al. (2005), "Erythrocyte aldehyde dehydrogenase activity: lack of association with alcohol use and dependence or alcohol reactions in Australian twins", Alcohol Alcohol,40(5), pp. 343-348. 52. NCCN (2013), NCCN practical guidelines in Oncology: Hepatobiliary
53. Jepsen P, Ott P, Andersen P.K, et al. (2012), "Risk for hepatocellular carcinoma in patients with alcoholic cirrhosis: a Danish nationwide cohort study", Ann Intern Med,156(12), pp. 841-847.
54. Brooks P.J., Theruvathu J.A. (2006), "Acetaldehyde-DNA adducts: implications for the molecular mechanism of alcohol related carcinogenesis",
Alcohol,35(3), pp. 187-193.
55. Xiao Q., Weiner H., Crabb D.W (1996), "The mutation in the mitochondrial aldehyde dehydroge nase (ALDH2) gene responsible for alcohol-induced flushing increases turnover of the enzyme tetramers in a dominant fashion",
Journal of Clinical Investigation,89(9), pp. 2027-2032.
56. Zhai Q., Shi X., Wu D (2006), "Alcohol-induced oxidative stress and cell responses", J Gastroenterol Hepatol,21(Suppl 3), pp. S26-9.
57. Barry R.E.., Williams A.J., Mcgivan J.D (1987), "The detection of acetaldehyde/liver plasma membrane protein adduct formed in vivo by alcohol feeding", Liver Cancer,7(6), pp. 364–368.
58. Kim S., Misra A (2007), "SNP genotyping: technologies and biomedical applications", Annu Rev Biomed Eng,9, pp. 289-320.
59. Mukherjee S (2014), "Alcohol metabolism and generation of free radicals: A deep insight.", OA Alcohol 2(1), pp. 1-5.
60. Villar S, Ortiz-Cuaran S, Abedi-Ardekani B, et al. (2012), "Aflatoxin- induced TP53 R249S mutation in hepatocellular carcinoma in Thailand: association with tumors developing in the absence of liver cirrhosis", PLoS One,7(6), pp. e37707.
61. Helmut K. Seitz., Felix Stickel (2010), "Alcetaldehyde as an underestimated risk factor for cancer development: role of genetics in ethanol metabolism",
Genes Nutr,5(2), pp. 121-128.
62. American Cancer Society (2016), Facts and Figures, Atlanta.
63. Hurley T.D., Edenberg H.J (2012), "Genes encoding enzymes involved in ethanol metabolism", Alcohol Res Health,34(3), pp. 339-344.