Do tái sinh chồi dưa hấu từ mô sẹo cần tới 6 tuần nuôi cấy trên môi trường tái sinh, đồng thời tỷ lệ chồi thu được từ các khối mô sẹo thấp, do đó để thu được số lượng chồi lớn hơn cho các thí nghiệm khác cần phải tiến hành nhân chồi có nguồn gốc từ mô sẹo. Các chất thuộc nhóm cytokinin có hoạt tính phân bào mạnh mẽ, do vậy sẽ kích thích quá trình hình thành chồi mới, làm gia tăng hệ số nhân chồi trong nuôi cấy in vitro. Trong các thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng riêng rẽ hai phytohormone phổ biến là BAP và kinetin ở các nồng độ khác nhau để kiểm tra ảnh hưởng đến quá trình phát sinh chồi dưa hấu. Theo tác giả Khatun và đồng nghiệp, môi trường khi có sự kết hợp giữa BAP hay KIN ở các nồng độ khác nhau với NAA hoặc IBA cho hệ số nhân chồi cao hơn so với môi trường chỉ bổ sung BAP, KIN [22].
Trước tiên, chúng tôi tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi dưa hấu có nguồn gốc từ mô sẹo. Trong các thí nghiệm này, môi trường đối chứng có thành phần như sau:
B0: MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar
Các môi trường thí nghiệm B1, B2, B3 và B4 được chuẩn bị như môi trường đối chứng B0 nhưng được bổ sung thêm BAP ở các nồng độ: 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l. Các chồi dưa hấu hình thành từ mô sẹo được dùng để cấy vào môi trường nhân chồi có BAP và tính toán hệ số nhân chồi sau 4 tuần nuôi cấy. Kết quả quan sát đã cho thấy, số lượng chồi thu được tăng lên gấp nhiều lần so với lượng chồi ban đầu đưa vào môi trường. Ở môi trường đối chứng không có BAP, hệ số nhân chồi sau 4 tuần là khá thấp đạt được khoảng 1,66. Trên môi trường B1 (0,5 mg/l BAP), hệ số nhân chồi đã tăng đáng kể, lên tới 4,33 khi so sánh với 1,66 của môi trường đối chứng. Ở môi trường B2 có nồng độ 1,0mg/l BAP từ số lượng chồi ban đầu là 30 đã hình thành tổng số 196 chồi sau khi được nuôi cấy 4 tuần và đạt hệ số nhân chồi là 6,53 lần (bảng 3.4). Ở giai đoạn nhân chồi, hệ số nhân chồi cao sẽ đáp ứng được yêu cầu thí nghiệm đặt ra về số lượng chồi. Với môi trường B4 có nồng độ BAP là 2,0 cũng đạt hệ số nhân chồi cao là 5,16 lần, tuy nhiên nhiều chồi có kích
31
thước nhỏ và khó quan sát rõ hình thái của chồi, do đó môi trường B2 có nồng độ BAP là 1,0mg/l được lựa chọn làm môi trường nhân nhanh chồi có nguồn gốc từ mô sẹo, tạo ra các chồi có hình thái rõ ràng với kích thước tương đối đồng đều nhau (hình 3.4).
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi
MT Nồng độ BAP (mg/l)
Số chồi ban đầu
Sau 4 tuần nuôi cấy
Số chồi thu đƣợc Hệ số nhân (lần)
B0 0,0 30 50 1,66 B1 0,5 30 130 4,33 B2 1,0 30 196 6,53 B3 1,5 30 146 4,86 B4 2,0 30 155 5,16
32
Để đánh giá ảnh hưởng của Kinetin (KIN) đến khả năng hình thành chồi có nguồn gốc từ mô sẹo, chúng tôi dùng môi trường đối chứng B0 có thành phần giống như môi trường đối chứng trong nghiên cứu ảnh hưởng của BAP.
B0: MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar
Các môi trường thí nghiệm K1, K2, K3 và K4 có các thành phần tương tự như môi trường B0 nhưng được bổ sung thêm KIN ở các nồng độ tương ứng là 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l. Khả năng hình thành các chồi mới trên những môi trường có KIN cũng được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy (bảng 3.5).
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của KIN đến hệ số nhân chồi
MT Nồng độ KIN (mg/l)
Số chồi ban đầu
Sau 4 tuần nuôi cấy
Số chồi thu đƣợc Hệ số nhân (lần)
B0 0 30 50 1,66
K1 0,5 30 73 2,43
K2 1,0 30 79 2,63
K3 1,5 30 87 2,9
K4 2,0 30 54 1,8
Các số liệu tính toán đã cho thấy, trên môi trường K1 có 0,5 mg/l KIN hệ số nhân chồi chỉ đạt được là 2,43 lần, cao hơn không nhiều so với môi trường đối chứng. Khi tăng nồng độ KIN lên 1,0mg/l ở môi trường K2 thì hệ số nhân đạt được là 2,63. Hệ số nhân chồi cao nhất trong số các môi trường thí nghiệm là 2,9 đạt được trên môi trường K3 có 1,5 mg/l KIN (hình 3.5). Có thể thấy rằng hệ số nhân chồi trên các môi trường có bổ sung KIN đều thấp hơn trên các môi trường có BAP. Đồng thời ở các môi trường có bổ sung KIN, khi quan sát quá trình tăng sinh chồi, chúng tôi thấy rằng mô sẹo có hình thành khá ở phần tiếp xúc của cụm chồi với môi
33
trường nuôi cấy, có thể gây ảnh hưởng tới việc hấp thụ các chất có trong môi trường. Vì lý do này môi trường có bổ sung BAP là phù hợp cho quá trình nhân chồi có nguồn gốc từ mô sẹo, trong đó môi trường B2 có nồng độ BAP là 1,0mg/l là môi trường thích hợp nhất.
Hình 3.5 Kết quả nhân chồi trên môi trường K3 sau 4 tuần