Tất cả 93 mẫu sinh thiết UTVH và 100 mẫu dịch phết tế bào vòm họng (mẫu lành) được tiến hành tách chiết miRNAs theo hướng dẫn của bộ kit mirVana™miRNA Isolation Kit (#Cat.AM1560, Thermo Fisher Sciencetific). Trong báo cáo này, chúng tôi trình bày đại diện kết quả tách chiết một số mẫu được thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả tách chiết miRNAs một số mẫu sinh thiết và một số mẫu dịch phết vòm họng. Mẫu (1) (2) (3) (4) Mẫu (1) (2) (3) (4) N1 1,26 0,61 2,05 41,45 P1 1,57 0,78 2,01 51,78 N2 1,43 0,74 1,94 47,03 P2 1,03 0,52 1,97 33,86 N3 1,30 0,70 1,86 42,97 P3 1,29 0,65 1,98 42,64 N4 1,63 0,90 1,81 53,76 P4 1,32 0,71 1,86 43,66
Trang 31 N5 1,78 0,96 1,87 58,87 P5 1,65 0,83 1,97 54,29 N6 1,85 1,00 1,85 60,89 P6 1,72 0,87 1,98 56,79 N7 1,82 0,90 2,03 60,09 P7 1,66 0,79 2,09 54,68 N8 1,89 0,90 2,10 62,34 P8 1,87 0,91 2,04 61,55 N9 1,58 0,81 1,94 52,07 P9 1,85 0,92 2,01 61,18 N10 1,99 1,09 1,82 65,57 P10 1,76 0,88 2,00 58,15 N11 2,16 1,02 2,12 71,35 P11 1,54 0,81 1,91 50,89 N12 1,97 0,99 1,98 64,85 P12 1,87 0,89 2,10 61,78 N13 1,85 0,89 2,07 60,89 P13 1,54 0,71 2,17 50,92 N14 1,63 0,90 1,81 53,92 P14 1,65 0,90 1,84 54,58 N15 1,76 0,89 1,99 58,15 P15 1,78 0,91 1,96 58,81 N16 1,81 0,92 1,98 59,80 P16 1,92 0,99 1,94 63,39 N17 1,35 0,71 1,89 44,39 P17 1,76 0,92 1,91 58,15 N18 1,60 0,81 1,97 52,73 P18 1,79 0,78 2,29 59,07 N20 1,87 0,93 2,02 61,78 P19 1,47 0,73 2,02 48,41 N21 1,98 0,92 2,16 65,41 P20 1,60 0,90 1,78 52,73 Ghi chú: (1): A260; (2): A280; (3) A260/A280; (4) C (μg/ml); N: mẫu mô sinh thiết UTVH; P: dịch phết vòm họng (mẫu lành).
Trang 32
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, độ tinh sạch mẫu miRNAs được đánh giá dựa trên tỷ lệ A260/A280. Giá trị mong đợi của tỷ số này nằm trong khoảng [1,8 – 2.,1]. Dựa trên kết quả giá trị OD thể hiện ở bảng 3.5 cho thấy: tỷ số A260/A280 ở các mẫu thực nghiệm đều nằm trong khoảng 1.8 ≤ A260/A280 ≤ 2.1, điều này chứng tỏ các mẫu tách chiết đều đạt độ tinh sạch cao và có thể sử dụng cho thí nghiệm phân tích sau này.
Khảo sát sự biểu hiện của miR-141 trên bộ mẫu UTVH và mẫu dịch phết vòm họng người Việt Nam
Tổng số miRNA của mẫu sinh thiết UTVH và mẫu dịch phết vòm họng được tách chiết bằng bộ kit mirVanaTMmiRNA Isolation Kit (Ambion, Life Technology). Việc kiểm tra sự biểu hiện của miR-141 được thực hiện với bộ mồi thân cuộn. Chứng nội cho phản ứng được sử dụng là U6snRNA. Kết quả kiểm tra chứng nội ở các mẫu thí nghiệm được thể hiện ở hình 4.5.
(A) (B)
Hình 4.5. Kết quả khuếch đại gen chứng nội U6snRNA ở các mẫu thí nghiệm (A) chu kỳ khuếch đại; (B) Đường cong nóng chảy của gen U6snRNA
Dựa trên kết quả phân tích, chu kỳ ngưỡng của U6snRNA ở mẫu sinh thiết UTVH và mẫu lành lần lượt là: 29,41 ± 1,56; 30,11 ± 1,61. Đồng thời, chúng tôi không ghi nhận được sự khác biệt có ý nghĩa giữa giá trị trung bình giá trị chu kỳ ngưỡng của U6snRNA ở mẫu sinh thiết UTVH và mẫu lành (p = 0,53). Do đó, chúng tôi sử dụng U6snRNA làm chứng nội để tính toán sự biểu hiện của miR-141 ở các mẫu thí nghiệm.
Trang 33
(A) (B)
Hình 4.6. Kết quả (A) Real-time PCR; và (B) điện di phát hiện miR-141 trên một số mẫu đại diện UTVH. (1) (6): mẫu mô sinh thiết UTVH; (7): chứng âm (nước). Kết quả khảo sát tính chất biểu hiện của miR-141 được thể hiện ở Bảng 4.6.
Bảng 4.6. Kết quả Tính chất biểu hiện của miR-141 ở UVTH và mẫu lành miR-141 P(%) N(%) Bệnh (n = 93) 63 (67,74) 30 (32,26) Lành (n = 100) 37 (37,00) 63 (63,00) p < 0,0001 OR 3,58 95% CI 1,97 – 6,48 p < 0,0001
Trang 34 RR 1,95 95% CI 1,40 – 2,72
p = 0,0001
Dựa trên kết quả khảo sát, tần số biểu miR-141 ở mẫu bệnh cao hơn so với mẫu lành, và sự chênh lệch này có rất chặt chẽ (p < 0,0001). Giá trị OR = 3,58 cho thấy nhóm có sự biểu hiện miR-141 với nguy cơ mắc bệnh (UTVH) cao gấp 3,58 lần so với nhóm không có sự biểu hiện miR-141 và sự chênh lệch này là rất đáng tin cậy (p < 0,0001). Giá trị RR = 1,95 ở nhóm có sự biểu hiện miR-141 cao gấp 1,95 lần so với nhóm không có sự biểu hiện miR- 141 và sự khác biệt này rất có ý nghĩa (p < 0,0001). Hay nói cách khác, giá trị OR và RR đều lớn hơn 1 cho ý nghĩa khả năng mắc bệnh UVTH khi có biểu hiện miR-141. (Ghi chú: Quy ước hệ thống điểm của giá trị kappa và AUC được thể hiện ở bảng 4.7).
Bảng 4.7. Hệ thống điểm của giá trị OR và RR trong y học (Medcalc © 2018). Giá trị OR Giá trị RR Điểm Ý nghĩa Điểm Ý nghĩa
> 1 Khả năng mắc bệnh cao hơn
khả năng không mắc bệnh > 1
Yếu tố phơi nhiễm làm tăng khả năng mắc bệnh
= 1
Khả năng mắc bệnh bằng khả
năng không mắc bệnh = 1
Không có mối liên hệ nào giữa yếu tố phơi nhiễm và khả
năng mắc bệnh < 1 Khả năng mắc bệnh thấp hơn
khả năng không mắc bệnh < 1
Yếu tố phơi nhiễm làm giảm khả năng mắc bệnh
Để đánh giá sự tăng biểu hiện của miR-141 ở mẫu bệnh so với mẫu lành, chúng tôi đồng thời tiến hành tính toán giá trị 2-Ct. Kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 4.8.
Trang 35
Bảng 4.8. Giá trị trung bình Ct của các mẫu sinh thiết mô UTVH và giá trị 2-Ct trong đánh giá biểu hiện các miR-141 so với chứng nội U6snRNA
Bệnh (Ct) Lành (Ct) miR-141 27,38 29,79 U6snRNA 29,41 30,11 Giá trị 2-Ct của miR-141/U6snRNA: 3,27
Như vậy, miR-141 có sự biểu hiện ở mẫu bệnh (sinh thiết mô UTVH) cao hơn lần lượt 3,27 lần so với mẫu lành. Dựa trên kết quả phân tích cho thấy sự biểu hiện của các miR- 141 làm tăng nguy cơ/ tỷ lệ mắc bệnh vòm họng so với không có sự biểu hiện của miR- 141. Điều này hoàn toàn phù hợp với công trình nghiên cứu trên thế giới (Bảng 4.3). Hay nói cách khác, miR-141 đóng vai trò là onco-miRNA.
Kết quả khảo sát tính chất biểu hiện của miR-141 với các đặc điểm lâm sàng trên mẫu UTVH được trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả thể hiện tính tương quan giữa miR-141, với các đặc điểm lâm sàng, trên mẫu sinh thiết mô UTVH
miR-141 P (%) N (%) Giới tính Nam Nữ 45 (48,39) 18 (19,35) 23 (24,73) 7 (7,53) p 0,78 Tuổi
Trang 36 ≤ 20 20 đến ≤ 40 40 đến ≤ 60 60 đến ≤ 80 > 80 1 (1,08) 11 (11,83) 29 (31,18) 21 (22,58) 1 (1,08) 0 (0,00) 6 (6,45) 14 (15,05) 10 (10,75) 0 (0,00) p 0,91 Giải phẫu bệnh Type 1 Type 2 Type 3 4 (4,30) 14 (15,05) 45 (48,39) 0 (0,00) 12 (12,90) 18 (19,35) p 0,10 Giai đoạn bệnh I II III IV 0 (0,00) 19 (20,43) 3 (3,23) 41 (44,09) 0 (0,00) 14 (15,05) 12 (12,90) 4 (4,30) p < 0,0001
Dựa trên kết quả phân tích mối tương quan giữa tính chất biểu hiện miR-141 với các đặc điểm lâm sàng: chúng tôi không ghi nhận được tính tương quan giữa miR-141 với các đặc điểm: giới tính, độ tuổi và giải phẫu bệnh (p > 0,05). Tính chất biểu hiện của miR-141 có sự tương quan chặt chẽ với giai đoạn bệnh, cụ thể tăng biểu hiện cao ở giai đoạn IV với 44,09% (41/93 mẫu) (đối với miR-141) và 40,86% (38/93 mẫu) (đối với miR-214). Sự tương quan này cũng được ghi nhận ở công trình nghiên cứu của Liu et al. (2016), Liu et al. (2018), Deng et al. (2013).
Trang 37
KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 6.1. Kết luận
Qua quá trình thực hiện đề tài, một số kết luận được rút ra như sau:
- Các nội dung nghiên cứu đã được thực hiện tốt, bám sát đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt.
- Các sản phẩm dạng III (công bố bài báo) đã đạt trên mức chỉ tiêu đã đăng ký (6 bài thuộc tạp chí ISI) và 3 bài thuộc tạp chí trong nước nằm trong danh mục tính điểm của HĐCDGSNN).
- Các sản phẩm dạng IV (đào tạo Sau đại học) vẫn đang được tiến hành tốt, các học viên và nghiên cứu sinh đều đã tham gia nghiên cứu, đang hoàn chỉnh luận văn, chuẩn bị trình Hội đồng tại các cơ sở đào tạo (dự kiến: trước tháng 9/2019).
Một số kết luận về mặt khoa học cũng được rút ra như sau:
- Hai phân tử miR-141, miR-214 có tính chất biểu hiện cao ở các mẫu sinh thiết mô UTVH so với các mẫu dịch phết lành. Cụ thể: miR-141, miR-214 có sự biểu hiện ở mẫu bệnh (sinh thiết mô UTVH) cao hơn lần lượt 3,27 và 4,82 lần so với mẫu lành. - Sự biểu hiện của miR-141, miR-214 có sự tương quan ý nghĩa với giai đoạn bệnh,
cụ thể với giai đoạn bệnh nặng (giai đoạn 4).
- Khi phân tích đồng thời sự biểu hiện ít nhất một trong hai phân tử miR-141 và miR- 214 (RPI ≥ 0,5) làm tăng giá trị OR, RR, nghĩa là làm tăng nguy cơ mắc bệnh UTVH. Đồng thời, giá trị RPI có sự tương quan với giai đoạn bệnh. Sự tương quan này có ý nghĩa về mặt thống kê.
- Các phân tử microRNA-141, microRNA-214 hoạt động như một oncogenic, có tính chất tăng biểu hiện ở ung thư vòm họng, người bệnh Việt Nam.
6.2. Kiến nghị
- - Tiếp tục công bố các kết quả nghiên cứu trên các tạp chí/hội thảo chuyên ngành - - Tiếp tục phát triển nghiên cứu, tập trung vào loại mẫu không xâm lấn như dịch
Trang 38
ở các giai đoạn sớm (I hoặc II) nhằm củng cố nhóm dữ liệu phân tử này; tiến tới ứng dụng trong việc chế tạo kít xét nghiệm hay dịch vụ khoa học hoặc thử nghiệm các phương pháp chẩn đoán hay điều trị dựa trên các tính chất biểu hiện của miRNA.
Trang 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Alajez NM, Shi W, Hui AB, Bruce J, Lenarduzzi M, Ito E, Yue S, O'Sullivan B, Liu FF. Enhancer of Zeste homolog 2 (EZH2) is overexpressed in recurrent nasopharyngeal carcinoma and is regulated by miR-26a, miR-101, and miR-98. Cell Death Dis. 2010; 1:e85.
Armstrong RW, Imrey PB, Lye MS, Armstrong MJ, Yu MC, Sani S. Nasopharyngeal carcinoma in Malaysian Chinese: occupational exposures to particles, formaldehyde and heat. Int J Epidemiol. 2000;29(6):991-8.
Bruce JP, Liu FF. MicroRNAs in nasopharyngeal carcinoma. Chin J Cancer. 2014; 33(11):539-544.
Cai X, Hagedorn CH, Cullen BR. (2004) Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA, 10(12): 1957-1966. Cao Y, Miao XP Huang, MY, Deng L, Hu LF, Ernberg I, Zeng YX, Lin DX, Shao JY. (2006), Polymorphisms of XRCC1 genes and risk of nasopharyngeal carcinoma in the Cantonese population. BMC Cancer, 6, pp. 167.
Chan AS, To KF, Lo KW, Mak KF, Pak W, Chiu B., Tse GM, Ding M, Li X, Lee JC, Huang DP. (2000), High frequency of chromosome 3p deletion in histologically normal nasopharyngeal epithelia from southern Chinese. Cancer Research, 60(19), pp. 5365-70.
Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J, Lee J, Provost P, Rådmark O, Kim S, Kim VN. (2003). The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature. 425(6956):415-419.
Lo KW, Mok CH, Huang DP, Liu YX, Choi PH, Lee JC, Tsao SW. (1992), p53 mutation in human nasopharyngeal carcinomas. Anticancer Research, 12(6B), pp. 1957-63.
Raab-Traub N. Epstein-Barr virus in the pathogenesis of NPC. Semin Cancer Biol. 2002, 12(6):431-41.
Trang 40
Sengupta S, den Boon JA, Chen IH, Newton MA, Stanhope SA, Cheng YJ, Chen CJ, Hildesheim A, Sugden B, Ahlquist P. MicroRNA 29c is down-regulated in nasopharyngeal carcinomas, up-regulating mRNAs encoding extracellular matrix proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105:5874–5878.
Sham JS, Poon YF, Wei WI, Choy D. (1990). Nasopharyngeal carcinoma in young patients. Cancer. 65, 2606-10.
Shao YM, Poirier S, Ohshima H, Malaveille C, Zeng Y, de Thé G, Bartsch H. (1988), Epstein-Barr virus activation in Raji cells by extracts of preserved food from high risk areas for nasopharyngeal carcinoma. Carcinogenesis, 9(8), pp. 1455-7.
Spence T, Bruce J, Yip KW, Liu FF. MicroRNAs in nasopharyngeal carcinoma. Chin Clin Oncol. 2016; 5(2):17.
Sun J, Lu H, Wang X, Jin H. (2013). MicroRNAs in Hepatocellular Carcinoma: Regulation, Function, and Clinical Implications. The Scientific World Journal. 2013:1-14.
Tao Q, Chan AT (2007). Nasopharyngeal carcinoma: molecular pathogenesis and therapeutic developments. Expert Rev Mol Med. 9(12), 1-24.
Wightman B, Ha I, Ruvkun G. (1993) Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell., 75(5): 855- 862.
Wong TS, Man OY, Tsang CM, et al. (2010). MicroRNA let-7 suppresses nasopharyngeal carcinoma cells proliferation through downregulating c-Myc expression. J Cancer Res Clin Oncol. 137(3), 415-22
Xia H, Ng SS, Jiang S, Cheung WK, Sze J, Bian XW, Kung HF, Lin MC. miR-200a- mediated downregulation of ZEB2 and CTNNB1 differentially inhibits nasopharyngeal carcinoma cell growth, migration and invasion. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 391(1):535-541.
Trang 41
Xu L, Yang M, Zhao T, Jin H, Xu Z, Li M, Chen H. The polymorphism of CYP2E1 Rsa I/Pst I gene and susceptibility to respiratory system cancer: a systematic review and meta- analysis of 34 studies. Medicine (Baltimore). 2014; 93(27):e178.
Yu MC, Ho JH, Lai SH, Henderson BE. Cantonese-style salted fish as a cause of nasopharyngeal carcinoma: report of a case-control study in Hong Kong. Cancer Res. 1986; 46(2):956-61.
Zen K, Zhang CY. (2012) Circulating microRNAs: A novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers, Medicinal Research Reviews, 32(2): 326-348.
Zhang JX, Qian D, Wang FW, Liao DZ, Wei JH, Tong ZT, Fu J, Huang XX, Liao YJ, Deng HX, Zeng YX, Xie D, Mai SJ. MicroRNA-29c enhances the sensitivities of human nasopharyngeal carcinoma to cisplatin-based chemotherapy and radiotherapy. Cancer Lett. 2013; 329(1):91–98.
Zhang L, Deng T, Li X, et al (2010) microRNA-141 is involved in a nasopharyngeal carcinoma-related genes network. Carcinogenesis. 31(4), 559-66.
Zhang ZC, Fu S, Wang F, Wang HY, Zeng YX, Shao JY. Oncogene mutational profile in nasopharyngeal carcinoma. Onco Targets Ther. 2014; 7:457-467.
Zhu X, Wang Y, Sun Y, Zheng J, Zhu D. Mir-155 up-regulation by lmp1 DNA contributes to increased nasopharyngeal carcinoma cell proliferation and migration. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2014;271: 1939–45
Trang 42
SẢN PHẨM KHOA HỌC – ĐÀO TẠO
6.3. Sản phẩm khoa học
Nhóm nghiên cứu đã công bố các công trình sau:
Thuan Duc Lao, Thuy Huyen Ai Le (2019). Development of stem-loop real-time PCR technique for miRNA-141 expression analysis in Vietnamese Nasopharyngeal carcinoma. Kuwait Medical Journal. (In press). (ISI/SCIe).
Lao Duc Thuan, Nguyen Van Truong, Nguyen Hoang Chuong, Nguyen Trong Minh, Nguyen Huu Dung, Le Huyen Ai Thuy (2018). MiR-141 is up-regulated in the biopsy sample of Vietnamese nasopharyngeal carcinoma patients. Brazilian Oral Research, 32(e126):1-7. (ISI/SCIe).
Lao Duc Thuan, Danh Hoang Nguyen, Thuy Ai Huyen Le (2018). Study of miR-141 and its potential targeted mRNA PTEN expression in Nasopharyngeal carcinoma: from in silico to initial experiment analysis. Asian J Pharmaceutical Research & Health Care, 10(3):1-9. (ISI/eSCI).
Thuan Duc Lao, Phuong Kim Truong, Thuy Ai Huyen Le (2018). miRNA-141 as the biomarker for human cancers. Asian J Pharmaceutical Research & Health Care, 10(2): 42- 49. (ISI/eSCI).
6.4. Sản phẩm đào tạo
1 sinh viên bảo vệ thành công khóa luận tốt nghiệp (năm 2019): sinh viên nguyễn hoàng danh (MSSV: 1553010019). Tên đề tài: khảo sát tính chất biểu hiện của microrna-141 và tính đa hình gene rpms1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam.