B. capitata 3
2.4.2. Phân lập hợp chất hữu cơ ở phân đoạn EA4.3 17
Kết quả SKLM phân đoạn EA4.3 (3.92 g) cho SKLM nhiều vết, có vết tách rõ nên phân đoạn EA4.3 được chọn để SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải EA–Me 80: 20, EA–Me–H2O 80:20:5 và EA–Me–H2O 80:20:10. Kết quả thu được 6 phân đoạn EA4.3.1–EA4.3.6, được trình bày trong bảng 2.3.
Từ phân đoạn EA4.3.3 (0.61 g) của bảng 2.3, tiếp tục SKC silica gel pha đảo nhiều lần với hệ dung môi rửa giải Me–H2O 43:7 thu được hợp chất Q1 (14.51 mg) ở dạng bột màu trắng.
Từ phân đoạn EA4.3.6 (0.29 g) của bảng 2.3, tiếp tục SKC silica gel pha đảo nhiều lần với hệ dung môi rửa giải Me–H2O 40:10 thu được hợp chất Q2 (10.88 mg) ở dạng bột màu trắng.
Bảng 2.3. Kết quả sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3
STT Phân đoạn
Dung môi giải ly
Trọng lượng
(g)
Sắc kí lớp mỏng Ghichú
1 EA4.3.1 EA–Me 80:20 0.47 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát 2 EA4.3.2 EA–Me 80:20 0.72 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát
3 EA4.3.3 EA–Me–H2O 80:20:5
0.61 Nhiều vết, tách tương đối
Tinh chế thu được hợp chất Q1
4 EA4.3.4 EA–Me–H2O 80:20:5
0.31 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát 5 EA4.3.5 EA–Me–H2O
80:20:10
6 EA4.3.6 C–Me–H2O 80:20:10
0.29 Nhiều vết, tách tương đối
Tinh chế thu được hợp chất Q2
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất Q1
Hợp chất Q1 (14.51 mg) thu được từ phân đoạn EA4.3 có những đặc điểm sau:
-Dạng bột màu trắng, tan trong methanol.
-SKLM với hệ giải ly C–Me–H2O 86:14:5, không hiện vết dưới đèn UV, dùng acid sulfuric 20% hơ nóng cho vết màu tím đậm.
-Phổ 1H-NMR (CD3OD, phụ lục 1): các độ chuyển dịch được trình bày trong bảng 3.1.
-Phổ 13C-NMR (CD3OD, phụ lục 2): các độ chuyển dịch được trình bày trong bảng 3.1.
-Phổ COSY (CD3OD, phụ lục 3). -Phổ HSQC (CD3OD, phụ lục 4). -Phổ HMBC (CD3OD, phụ lục 5).
Biện luận cấu trúc
Phổ 1HNMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton olefin tại H 5.28 (1H, brs, H12), tín hiệu cộng hưởng của hai proton anomer tại H 4.50 (1H, d, 7.5 Hz, H1') và H 4.52 (1H, d, 7.5 Hz, H1"). Bên cạnh đó, phổ đồ cũng xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của các proton gắn trên carbon mang oxygen trong vùng H 4.343.24, cùng các tín hiệu của 6 nhóm methyl gắn trên carbon tứ cấp cộng hưởng dưới dạng mũi đơn tại H 1.30, 1.19, 0.96, 0.96, 0.93 và 0.87.
Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất Q1 có hơn 30 carbon. Trong đó có sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của hai carbon olefin ở C 145.4 (C13) và 123.6 (C12), hai carbon anomer cộng hưởng tại δC 106.0 và 105.2. Bên cạnh còn có sự xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của các carbon mang oxygen trong vùng δC 88.062.2 ppm.
Với các dữ liệu NMR trên cho phép dự đoán hợp chất Q1 là một triterpene có khung sườn oleanane và có gắn hai phân tử đường.
Phổ HSQC cho thấy tương quan giữa proton olefin cộng hưởng tại H 5.28 với carbon olefin cộng hưởng tại C 123.6, hai proton oxymethylene cộng hưởng tại H 3.64 và H 3.25 tương quan với carbon cộng hưởng tại C 65.7 (C23). Ngoài ra còn có các tương quan HSQC khác giúp xác định sự gắn kết proton trên các carbon tương ứng.
Phổ HMBC cho thấy tương quan giữa proton olefin cộng hưởng tại H 5.28 với các carbon cộng hưởng tại C 43.2 (C14), 49.5 (C9) và proton của nhóm methyl cộng hưởng tại H 1.19 (H27) cho tương quan với carbon olefin =C< cộng hưởng tại C 145.4 giúp xác định lại vị trí nối đôi tại C12 và C13. Bên cạnh, hai proton oxymethylene cộng hưởng tại H 3.64 (H23a) và 3.25 (H23b) cho tương quan với các carbon ở C 84.0 (C3), 48.2 (C5), 43.1 (C4), 14.7 (C24) giúp xác định carbon C23 (C 65.7) mang nhóm OH. Một số tương quan HMBC khác được thể hiện qua hình 3.2.
Phổ COSY cho thấy sự tương quan của proton oxymethine cộng hưởng tại H 4.34 với các proton cộng hưởng tại H 3.64 (H3), 2.06 (H1a) và 2.09 (H1b) giúp xác định carbon C2 mang nhóm OH.
Từ những dữ liệu trên, khung aglycon của hợp chất Q1 được dự đoán là oleanolic acid có mang 2 nhóm OH ở vị trí C2 và C23. Proton H2 có hằng số ghép J = 3.0 Hz giúp xác định OH ở vị trí C2 định hướng .
Tương quan HMBC từ proton anomer δH 4.51 (δC 105.2) đến carbon C3 (δC 84.0) và ngược lại tín hiệu proton H3 (H 3.64) cho tương quan với C1' (C 105.2) giúp dự đoán phân tử đường thứ nhất gắn vào khung aglycon ở vị trí C3. Proton anomer thứ hai δH 4.52 (δC 106.0) tương quan HMBC với carbon cộng hưởng tại C 88.0 (C3') và ngược lại tín hiệu proton H3' (H 3.52) cho tương quan với C1'' (C 106.0) giúp xác định phân tử đường thứ hai gắn vào phân tử đường thứ nhất tại C3'.
Kết hợp phổ COSY, HMBC, HSQC giúp xác định phân tử đường thứ nhất có các carbon cộng hưởng tại C 105.2, 74.6, 88.0, 69.4, 77.4, 62.2 (C1', C2', C3', C4', C5', C6') và phân tử đường thứ hai có các carbon cộng hưởng tại C 106.0, 74.6, 77.7, 71.2, 67.1 (C1", C2", C3", C4", C5"). Dựa vào hằng số ghép J của H4' (H 3.46, dd, 9.5, 8.5 Hz) và H3" (H 3.37, dd, 9.0, 9.0 Hz) giúp dự đoán phân tử đường thứ nhất là glucose và phân tử đường thứ hai là xylose.
Từ tất cả dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q1 kết hợp so sánh với số liệu phổ nghiệm của hợp chất 3-O-β-D-xylopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranosyl-2,23- dihydroxyoleanolic acid [25] (bảng 3.1) cho thấy có sự tương đồng. Vậy cấu trúc hóa học của hợp chất Q1 được đề nghị là 3-O-β-D-xylopyranosyl-(13)-β-D- glucopyranosyl-2,23-dihydroxyoleanolic acid.
Hình 3.1. Cấu trúc 3-O-β-D-xylopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranosyl-2,23- dihydroxyoleanolic acid (Q1).
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất Q1 và hợp chất so sánh(*) Vị trí carbon Q1 (CDH (ppm), J (Hz) 3OD)C(ppm) Hợp chất so sánh (*) (pyridine-d5) C (ppm) 1 44.4 44.1 2 4.34 (m) 71.2 70.8 3 3.64 (d, 4.0) 84.0 82.7 4 43.1 42.8 5 48.2 47.5 6 18.6 17.9 7 33.9 32.9 8 40.6 39.8 9 49.2 48.5 10 37.5 36.9 11 24.7 23.9 12 5.28 (brs) 123.6 122.7 13 145.4 144.8 14 43.2 42.2 15 28.8 28.2 16 24.1 23.6 17 47.7 46.6 18 2.88 (dd, 14.0, 4.0) 42.8 41.9 19 47.3 46.3 20 31.6 30.9 21 35.0 34.1 22 33.5 33.2 23 3.64 (3.25 (dd, 11.0), 10.5) 65.7 64.8 24 0.96 (s) 14.7 15.0 25 1.30 (s) 17.5 17.1 26 0.85 (s) 17.9 17.4 27 1.19 (s) 26.5 26.2 28 182.1 180.1 29 0.93 (s) 24.0 23.7 30 0.96 (s) 33.6 33.2 Glc 1' 4.51 (d, 7.5) 105.2 105.5 2' 3.48 (dd, 9.0, 7.5) 74.6 74.3 3' 3.52 (dd, 9.5, 9.0) 88.0 87.6 4' 3.46 (dd, 9.5, 8.5) 69.4 69.3 5' 3.44 (m) 77.4 77.9 6' 3.83 (3.72 (dddd, 12.0, 2.5), 12.0, 4.0) 62.2 62.1 Xyl 1" 4.52 (d, 7.5) 106.0 106.3 2" 3.30 (dd, 9.0, 7.5) 75.3 75.3 3" 3.37 (dd, 9.0, 9.0) 77.7 78.2 4" 3.54 (m) 71.2 70.8 5" 3.93 (3.28 (ddm) , 11.5, 5.5) 67.1 67.4 (*) Hợp chất so sánh: 3-O-β-D-xylopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranosyl-2,23- dihydroxy-oleanolic acid [25].
3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất Q2
Hợp chất Q2 (10.88 mg) thu được từ phân đoạn EA4.3 có những đặc điểm sau:
-Dạng bột màu trắng, tan tốt trong methanol.
-SKLM với hệ giải ly CMeH2O 40:10:1, hiện vết dưới đèn UV, dùng với acid sulfuric 20% hơ nóng cho vết màu tím hồng.
-Phổ 1H-NMR (CD3OD, phụ lục 6): các độ chuyển dịch được trình bày trong bảng 3.2.
-Phổ 13C-NMR (CD3OD, phụ lục 7): các độ chuyển dịch được trình bày trong bảng 3.2.
-Phổ COSY (CD3OD, phụ lục 8). -Phổ HSQC (CD3OD, phụ lục 9). -Phổ HMBC (CD3OD, phụ lục 10).
Biện luận cấu trúc
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton anomer tại δH 5.39 (1H, d, 1.0 Hz) và 4.43 (1H, d, 7.5 Hz), các proton gắn trên carbon mang oxygen cộng hưởng trong vùng δH 4.433.20. Ngoài ra còn có các tín hiệu của 8 nhóm methyl gắn trên carbon tứ cấp tại δH 1.25, 1.23, 1.08, 1.07, 1.05, 0.94 và 0.87, trong đó có proton của một nhóm methyl xuất hiện dưới dạng mũi đôi tại δH 1.23 (d, 6.5 Hz) giúp dự đoán trong cấu trúc hợp chất Q2 có chứa phân tử đường rhamnose.
Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất Q2 có hơn 30 carbon. Trong đó 2 carbon anomer cộng hưởng tại δC 105.6 và 101.9, các carbon mang oxygen cộng hưởng trong vùng δC 90.3-62.8 ppm.
Qua những dữ liệu NMR trên giúp dự đoán hợp chất Q2 là một triterpene có gắn hai phân tử đường.
Kết hợp phổ HSQC và HMBC cho thấy hợp chất Q2 có carbon olefin tứ cấp tại δC 150.9 và hai carbon >C=O ở δC 213.0 và 180.0 ppm.
Sự biến mất của proton olefin trong khung triterpene cùng với sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng carbon olefin >C= tại δC 150.9 giúp dự đoán hợp chất Q2 có nối đôi dạng >C=C<.
Tương quan HMBC từ proton của hai nhóm methyl cộng hưởng tại δH 0.86 và 1.07 đến các carbon cộng hưởng tại δC 90.2 (>CHO); 40.4 (>C<, C-4); 57.4 (>CH, C5) giúp xác định hai nhóm methyl này ở vị trí C4. Proton của nhóm methyl cộng hưởng tại δH 1.25 cho tương quan với các carbon cộng hưởng tại δC 150.9 (>C=, C13); 46.3 (>C<, C14); 44.0 (>C<, C8) và 29.2 (CH2, C15) giúp dự đoán nối đôi ở vị trí C13. Ngoài ra, tương quan giữa các proton của hai nhóm methyl cộng hưởng tại δH 1.08 và 1.05 tới các carbon cộng hưởng tại δC 213.0 (>C=O), 46.4 (>C<, C-20), 37.5 (CH2) giúp dự đoán nhóm oxo nằm ở vị trí C19 hoặc C21. Một số tương quan HMBC khác được thể hiện qua hình 3.2.
Từ những dữ liệu trên giúp dự đoán hợp chất Q2 là triterpenoid có khung sườn oleanan, có nối đôi >C= ở vị trí C13, một nhóm oxo (>C=O) và có gắn thêm hai phân tử đường.
Khi thực hiện SKLM hợp chất Q2 với hệ dung môi CMeH2O 40:10:1 cho vết hấp thu UV giúp dự đoán hợp chất có nối đôi liên hợp.
Trong khung sườn oleanane, khi nối đôi >C=C< ở vị trí C13 và C18 thì độ dịch chuyển hóa học δC của hai carbon C13 và C18 nằm trong khoảng 135.6126.3 ppm [26]. Khi nối đôi C13 và C18 liên hợp với nối đôi >C=O ở vị trí C19 thì C13 và C18 có độ dịch chuyển hóa học δC 151.1 (C13) và 134.2 (C18) [27].
Kết hợp so sánh số liệu phổ NMR của hợp chất Q2 với số liệu NMR của hợp chất 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-olean-13(18)-ene-28-oic acid (hợp chất so sánh) cho thấy có sự tương đồng ở vòng D, E (bảng 3.2) nên dự đoán hợp chất Q2 có nối đôi tại vị trí C13 và C18.
Tương quan HMBC từ proton anomer δH 4.43 (δC 105.6) đến carbon C3 (δC 90.2) giúp dự đoán phân tử đường thứ nhất gắn vào khung aglycon ở C3. Proton anomer thứ hai δH 5.39 (δC 101.9) tương quan với carbon cộng hưởng tại δC 80.0 (C2') giúp xác định phân tử đường thứ hai gắn vào phân tử đường thứ nhất tại vị trí C2'.
Kết hợp phổ COSY, HSQC, HMBC xác định được phân tử đường thứ nhất có các carbon cộng hưởng tại δC 105.6, 79.0, 79.5, 72.1, 77.6, 62.8 và phân tử đường thứ hai có các carbon cộng hưởng tại δC 101.9, 72.1, 72.2, 74.0, 70.0 và 18.0.
Proton H4' cộng hưởng dưới dạng mũi đôi-đôi với hằng số ghép J=8.5, 8.0 Hz giúp dự đoán H4' nằm ở vị trí xích đạo như vậy phân tử đường thứ nhất là β- D-glucose. Từ những dữ liệu NMR trên, cấu trúc của hợp chất Q2 được đề nghị là 3-O-(α-L-rhamnopyranosyl-(12)-β-D-glucopyranosyl)-19-oxo-olean-13(18)- ene-28-oic acid. Hình 3.3. Cấu trúc hợp chất Q2
Hình 3.4. Một số tương quan HMBC của hợp chất Q2
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất Q2 và hợp chất so sánh(**) Vị trí carbon Q2 (CD3OD) Hợp chất so sánh (**) (pyridine-d5) δH (ppm) (J-Hz) δC(ppm) δC(ppm) 1 35.5 43.4 2 27.4 66.4 3 3.22 (dd, 11.5, 7.5) 90.2 79.4 4 40.3 38.9 5 57.4 48.9 6 18.4 18.4 7 40.4 34.7 8 44.0 43.4 9 52.4 51.3 10 38.3 39.1 11 23.7 23.3 12 28.2 27.4 13 150.9 151.1 14 46.3 45.8 15 29.2 28.6 16 32.7 32.2 17 52.4 53.1 18 134.2 19 213.0 208.0 20 46.4 45.5 21 37.5 36.4 22 36.1 35.2 23 1.07 (s) 28.5 29.6 24 0.86 (s) 17.1 22.3 25 0.94 (s) 17.2 17.7 26 0.94 (s) 18.4 17.8 27 1.25 (s) 21.2 21.0 28 180.0 178.4 29 1.08 (s) 25.6 25.9 30 1.05 (s) 25.0 24.7 Glc 1' 4.43 (d, 7.5) 105.6 2' 3.42 (dd, 9.0, 7.5) 79.0 3' 3.49 (dd, 9.0, 8.5) 79.5 4' 3.31 (dd, 8.5, 8.0) 72.1 5' 3.26 (m) 77.6 6' 3.89 (dd, 12.0, 2.0) 3.68 (dd, 12.0, 5.0) 62.8 Rha 1'' 5.39 (d, 1.0) 101.9 2'' 3.97 (dd, 3.0, 1.5) 72.1 3'' 3.77 (dd, 10.0, 3.5) 72.2 4'' 3.40 (dd, 10.0, 9.5) 74.0 5'' 4.00 (d, 3.5) 70.0 6'' 1.23 (d, 6.5) 18.0 (**) Hợp chất so sánh: 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-olean-13(18)-ene-28-oic acid [27]
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Cây Ruột gà dạng hóng Spermacoce ocymoides Burm.f., họ Cà phê (Rubiaceae) được thu hái tại Long An vào năm 2016 được định danh bởi TS. Đặng Văn Sơn, Viện Sinh học nhiệt đới miền Nam. Cây sau khi thu hái được rửa sạch, phơi khô ở nhiệt độ phòng, sau đó đem xay thành bột khô (10,5 kg). Bột này được sử dụng phương pháp ngâm dầm để điều chế cao ethanol ban đầu. Sau đó dùng phương pháp chiết lỏng lỏng với n-hexane, ethyl acetate để điều chế các loại cao tương ứng.
Bằng các kỹ thuật sắc ký cột, sắc kí lớp mỏng, hai hợp chất với kí hiệu lần lượt là Q1 (14.51 mg), Q2 (10.88 mg) đã được cô lập từ phân đoạn cao ethyl acetate EA4.
Bằng phương pháp phổ nghiệm và đối chiếu với các tài liệu tham khảo, cấu trúc hóa học của hai hợp chất nói trên được đề nghị là 3-O-β-D-xylopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranosyl-2,23-dihydroxyoleanolic acid (Q1) và 3-O-(α-L-rhamnopyranosyl-(12)-β-D-glucopyranosyl)-19-oxo-olean- 13(18)-ene-28-oic acid (Q2).
3-O-β-D-xylopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranosyl-2,23-dihydroxyoleanolic acid
3-O-(α-L-rhamnopyranosyl-(12)-β-D-glucopyranosyl)-19-oxo-olean-13(18)- ene-28-oic acid (Q2)
Trong phạm vi của khóa luận, chúng tôi chỉ mới nghiên cứu phân đoạn EA4 cao ethyl acetate của cây Ruột gà dạng hóng. Trong thời gian sắp tới, nếu có đủ điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục khảo sát các phân đoạn khác của cao ethyl acetate của cây Ruột gà dạng hóng để có thể cô lập thêm những hợp chất khác.