3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose
Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR xác định giới tính là 1,5%; 2% đối với sản phẩm PCR xác định gen halothane. Ví dụ để chuẩn bị 1,5% ta làm nhƣ sau: cân 0,225 g agarose hoà tan trong 15 ml TBE 0,5 X lắc đều. Đun agarose trong lò viba ở 650 w trong 2 phút. Để gel nguội đến khoảng 50oC, đổ vào khuôn có gắn lƣợc. Chờ gel đông và rút lƣợc ra.
3.4.5.2. Kết quả điện di PCR
Dùng 7,5 µl sản phẩm PCR trộn với 1,5 µl loading dye 6 X. Điện di 30 phút trong TBE 0,5 X với dòng điện 100 V, 250 mA. Vớt gel ra khỏi buồng diện di và cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 0,1% trong 30 phút. Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết quả.
3.5. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu với các hàm thống kê trong Excel và phần mềm Statgraphics 7.0.
Tên giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian
Biến tính hoàn toàn 94 3 phút
35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 54 72 45 giây 90 giây 90 giây
Kéo dài cuối cùng 72 5 phút
18
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích DNA DNA lông bò đƣợc ly trích từ các nồng độ Ca2+, kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA lông bò đƣợc ly trích từ các nồng độ Ca2+, kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+
Chỉ tiêu Nồng độ Ca 2+ P 2 mM 6 mM 10 mM Tỷ số OD (X± SD) 1,6 0,08 1,62 0,12 1,69 0,15 0,49 Hàm lƣợng DNA (X± SD) (µg/µl) 0,51 0,22 0,24 0,13 0,3 0,3 0,19 Số mẫu 5 5 5 1.6 1.62 1.69 0.51 0.24 0.3 0 0.5 1 1.5 2 2 mM 6 mM 10 mM Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.1: Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+
Sự khác biệt về tỷ số OD và nồng độ DNA không nhiều (P > 0,05). Trong thí nghiệm của McNevin và ctv (2005), ông ta đã đề nghị một dung dịch đệm ly trích có sử dụng Proteinase K và bổ sung 40 mM Ca2+. Do đó, có thể bố trí thêm nhiều thí nghiệm ở các nồng độ Ca2+
từ 10 mM đến 40 mM để xác định nồng độ Ca2+ nào cho hiệu quả tối ƣu nhất. Trong các kết quả ly trích trên, dung dịch đệm ly trích chứa 10 mM Ca2+ có tỷ số OD cao nhất nên lấy DNA để chạy PCR. Phản ứng PCR từ lông bò chỉ khuếch đại đƣợc 1 băng dài 370 bp nên không đạt yêu cầu. Kết quả PCR xác định gen halothane cũng âm tính trên 2 mẫu.
La Ca Ca Ca Ca ĐC
655 bp 370 bp
19
Hình 4.1: Kết quả PCR từ mẫu có 10 mM Ca2+
La: ladder, Ca: 10mM Ca2+, ĐC: đối chứng là sản phẩm PCR với DNA ly trích từ cơ vân
4.2. Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò
DNA đƣợc ly trích từ mẫu gốc lông dài khoảng 5 cm tính từ gốc và mẫu ngọn
lông dài khoảng 5 cm ở phần đuôi của thân lông. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.2a.
Bảng 4.2a. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 vị trí lông bò
Chỉ tiêu Gốc lông Thân lông P
Tỷ số OD 1,76 0,09 1,2 0,07 0,0001
Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,34 0,28 0,07 0,03 0,04 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số mẫu 5 6
Biểu đồ 4.2: Tỷ số OD của DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông bò
655 bp 370 bp 1.76 1.2 0.34 0.07 0 0.5 1 1.5 2
Gốc lông Thân lông
Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
20
Bảng 4.2b. Kết quả PCR từ 2 vị trí lông bò Mẫu Số mẫu tiến
hành Số mẫu có sản phẩm PCR Tỷ lệ mẫu có sản phẩm PCR P Gốc lông 5 5 100% 0,0414 Ngọn lông 6 0 0%
Có sự khác biệt đáng kể giữa tỷ số OD và hàm lƣợng DNA của mẫu gốc và thân lông bò (P < 0,05). Càng xa phần gốc thì lông càng bị keratin hoá và ít tế bào sống (Wagner và ctv, 1996). Do đó, DNA ly trích từ phần thân lông sẽ ít và lẫn tạp chất nhiều hơn so với phần gốc lông. Theo Sambrook và ctv (2001), độ tinh sạch của DNA ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả PCR. DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 đƣợc xem là sạch. Ở đây, mẫu ngọn lông có tỷ số OD trung bình là 1,2. Tỷ số này thấp chứng tỏ lƣợng protein trong dịch DNA còn nhiều. Điều này là rõ ràng bởi vì càng xa gốc thì lông càng bị keratin hóa mạnh. Do đó, sản phẩm PCR của mẫu ngọn lông không đƣợc tạo thành. Tuy nhiên, sản phẩm PCR chỉ có 1 băng 370 bp khi dùng DNA ly trích từ gốc lông, nhƣ thế sản phẩm PCR vẫn chƣa đạt yêu cầu.
Hình 4.2: Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông bò
N: ngọn, G: gốc, ĐC: đối chứng là sản phẩm PCR với DNA ly trích từ cơ vân
4.3. Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò
Các mẫu đƣợc ly trích từ gốc lông, tỷ số OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong Bảng 4.3.
N N N N G G G G G ĐC
655 bp 370 bp
21
Bảng 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 nguồn lông
Chỉ tiêu Lông bò Lông heo P
Tỷ số OD 1,82 0,08 1,69 0,11 0,07
Hàm lƣợng DNA (µg/ µl) 0,31 0,3 0,09 0,05 0,14
Số mẫu 5 5
Biểu đồ 4.3: Tỷ số OD của DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và lông bò
Tỷ số OD giữa DNA gốc lông của heo và bò không có sự khác biệt nhiều (P > 0,05). Sản phẩm PCR của DNA ly trích từ lông heo không cho băng nào. Có thể trong DNA ly trích từ lông heo vẫn còn tạp chất hoặc vì lý do khác, cần làm thêm vài thí nghiệm để giải thích rõ.
Hình 4.3: Kết quả PCR với DNA từ gốc lông heo và gốc lông bò H: heo, B: bò H H H H H B B B B B 370 bp 1.82 1.69 0.31 0.09 0 0.5 1 1.5 2
Lông bò Lông heo
Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
22
Bảng 4.4. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT
Chỉ tiêu Không DTT DTT P
Tỷ số OD 1,58 0,14 1,84 0,09 0,008
Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,3 0,18 0,21 0,13 0,44
Số mẫu 5 5
Biểu đồ 4.4: So sánh DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT và không có DTT
Có sự khác biệt về tỷ số OD giữa việc sử dụng DTT và không sử dụng DTT (P < 0,05). Tỷ số OD của dung dịch đệm ly trích theo DTT đạt khoảng tinh sạch (1,8 – 2). Gen giới tính (2 mẫu) từ lông bò và gen halothane từ lông heo có bổ sung DTT không có dấu hiệu phản ứng. Kalbe và ctv (1988) chứng tỏ rằng sự hiện diện của DTT trong dung dịch đệm ly trích làm giảm rõ rệt lƣợng DNA ly trích, và điều này có thể làm giảm việc gắn kết giữa các deoxyribose nucleotides trong DNA và làm chúng không thể đƣợc nhận biết bởi Taq polymerase (McNevin và ctv, 2005). Đó có thể là một giả định để giải thích tại sao sản phẩm PCR không đƣợc thấy. Kết quả PCR xác định gen halothane âm tính trên 1 mẫu.
.
Hình 4.4: Kết quả PCR từ mẫu có DTT và không DTT
370 bp 1 1 2 2 1.58 1.84 0.3 0.21 0 0.5 1 1.5 2 Không DTT DTT Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 1: DTT 2:Không DTT
23
4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin Bảng 4.5. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mẫu CTAB Bảng 4.5. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mẫu CTAB
Chỉ tiêu CTAB P
0,0% 0,06% 0,2%
Tỷ số OD 1,84 0,09 1,6 0,04 1,3 0,03 0,001 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,17 0,04 0,16 0,06 0,1 0,02 0,46
Số mẫu 5 5 5
Biểu đồ 4.5: Tỷ số OD của DNA ly trích bởi dung dịch đệm có và không có CTAB
Có sự sai biệt giữa tỷ số OD và hàm lƣợng DNA từ quy trình ly trích DTT không sử dụng CTAB và quy trình có CTAB. Sử dụng CTAB ở nồng độ càng cao thì độ tinh sạch của DNA càng giảm. Theo Sambrook và ctv (2001), CTAB đƣợc loại ra khỏi dung dịch kết tủa DNA bằng hỗn hợp phenol. Tuy nhiên có lẽ hỗn hợp phenol chƣa thể loại hết đƣợc CTAB ra khỏi dung dịch kết tủa DNA, do đó cần phải tìm thêm chất nào đó để có khả năng loại bỏ CTAB hiệu quả hơn. DNA từ dung dịch đệm có bổ
xung CTAB 0,06% chạy PCR đối với gen giới tính và halothane đều không có dấu hiệu phản ứng.
4.6. Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA trong phản ứng PCR
Bảng 4.6. Kết quả PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung Nồng độ BSA (µg/µl) Số mẫu tiến hành Kết quả PCR *
0 4 Băng 370 bp 0,0005 1 Băng 370 bp 0,01 1 Băng 370 bp 1.84 1.6 1.3 0.17 0.16 0.1 0 0.5 1 1.5 2
CTAB 0,0% CTAB 0,06% CTAB 0,2%
Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl)
24 * Chỉ phát hiện băng ngắn của gen giới tính, không có sản phẩm PCR của gen halothane.
Sản phẩm PCR từ DNA ly trích từ lông bò chỉ cho 1 băng dài 370 bp. Số mẫu có sản phẩm PCR là các mẫu có BSA ở các nồng độ 0,0005 µg/µl; 0,01 µg/µl; còn những mẫu dùng BSA ở các nồng độ 0,1 µg/µl; 0,5 µg/µl không cho sản phẩm PCR. Một mẫu DNA ly trích từ lông heo có bổ sung BSA ở 0,1 µg/µl; 0,5 µg/µl cho sản phẩm âm tính.
Nồng độ BSA càng nhỏ thì băng điện di càng sáng. Điều đó có thể cho thấy rằng lƣợng BSA thêm nhiều trong phản ứng PCR sẽ trở thành chất ức chế phản ứng.
Hình 4.6: Kết quả PCR từ mẫu sử dụng BSA và không sử dụng BSA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Qua 6 thí nghiệm, PCR xác định gen giới tính chỉ có 1 băng 370 bp; PCR xác định gen halothane không cho băng nào. Trong thí nghiệm về đánh giá sự ly trích từ lông rụng tự nhiên, Vigilant (1999) thấy rằng DNA ty thể có thể khuếch đại những đoạn lên tới 300 bp với tỷ lệ thành công là 80%, giảm xuống 60% đối với những đoạn 400 bp và 15% cho những đoạn 500 bp (McNevin và ctv, 2005). Cũng theo McNevin và ctv (2005), ngƣời ta nghĩ rằng DNA ty thể dễ dàng ly trích từ lông hơn vì nó hiện diện với số lƣợng lớn. Allen và ctv (1998) tìm thấy rằng sự khác nhau trong số lƣợng DNA đòi hỏi cho sự khuếch đại PCR thành công là sự phù hợp với số lƣợng copy của mỗi tế bào, DNA nhân (1 copy 1 tế bào) và DNA ty thể (103
– 104 mỗi tế bào). Do đó, chúng tôi nghĩ rằng quy trình ly trích lông chƣa đƣợc tối ƣu hoá nên không thể kéo dài băng 655 bp đối với gen giới tính và 586 bp đối với gen halothane.
1 2 3 4 ĐC ĐC 5 6 655 bp 370 bp 1,2: Không BSA 3: 0,0005 ng/µl BSA 4: 0,01 ng/µl BSA 5: 0,1 µg/µl BSA 6: 0,5 µg/µl BSA
25
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K và Ca2+ ở các nồng độ 2 mM, 6 mM, 10 mM cho DNA với tỷ số OD khoảng 1,6 – 1,69. Trong đó, sản phẩm PCR từ DNA của gốc lông bò ly trích bởi dung dịch đệm 10 mM Ca2+ cho 1 băng dài 370 bp.
- DNA từ gốc lông bò (tỷ số OD trung bình 1,76) có độ tinh sạch và hàm lƣợng cao hơn DNA từ ngọn lông ( OD = 1,2).
- Mẫu gốc lông heo và gốc lông bò không khác nhau về tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích.
- DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh sạch hơn DNA từ dung dịch đệm không có DTT (1,58).
- Nồng độ CTAB trong quá trình ly trích ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA. - Sử dụng nồng độ BSA từ 0,0005 µg/µl đến 0,5 µg/µl trong phản ứng PCR vẫn không cải thiện đƣợc hiệu quả PCR khi dùng DNA từ mẫu lông.
- Quy trình ly trích với dung dịch đệm chứa proteinase K và Ca2+ hiệu quả trong ly trích DNA với những đoạn khuếch đại dƣới 400 bp.
Tóm lại, Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích đã cải thiện tỷ số OD nhƣng chỉ cho sản phẩm PCR ngắn (370 bp) của gen giới tính và không có sản phẩm PCR của gen halothane.
5.2. Đề nghị
- Làm thêm thí nghiệm với nồng độ Ca2+ từ 10 – 40 mM để xác định nồng độ nào cho hiệu quả tối ƣu nhất.
26
PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO
*Tài liệu Tiếng Việt
1. Lê Thị Thu Phƣơng, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
2. Nguyễn Văn Út, 2005. Xác định giới tính bằng kỹ thuật Multiplex PCR trên 3 giống bò. Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
*Tài liệu Tiếng Anh
3. Biorad, 2005. 2 - D electrophoresis for proteomics: A method and product manual.
4. Dale J. W., Schantz M. V., 2002. From genes to genomes: Concepts and applications of DNA technology. From genes to genomes. Copy right John Wiley Sons, Ltd.
5. Eggling S., 2001 - 2003. Structual protein. Clackamas Community College, Hal Bender. http://dl.clackamas.cc.or.us/ch106 - 08/structural proteins.htm.
6. Galan M., Baltzinger C., Hewison A. J. M., Cosson J., 2003. Deer species identification using DNA extracted from hair samples and the polymerase
chain reaction (PCR) method. Trends in Ecology and Evolution. 12: 223 – 227.
7. Haase A., Retzel E. F., Stakus K. A., 1990. Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells. Proc Natl Acad SC! USA . 87,4971 – 4975.
8. Hair handout, 2005. CHEM 107. http:// www.fbi.gov
9. James N. J., Mary V. A., 2004. Genetic variability and population differentiation in Captive Baird’s Tapirs (Tapirus bairdii). Zoo Biology. 23:521– 531.
27 10. McNevin D., Wilson - Wilde L., Robertson J., Kyd J., Lennard C., 2005. Short tandem repeat (STD) genotyping of keratinised hair. Forensic Science International.153 : 237 – 259. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
11. Morel G., Berger M., Ronsin B., Recher S., Richard- Blum S., Mertani H.C. , Lobie P. E., 1998. In situ reverse transcription - polymerase chain reaction. Applications for light and electron microscopy. Biology of the Cell. 90: 137 - 154.
12. Nozawa H.D., Yanamoto T., Uchihi R., Yoshimoto T., Tamoaki K., Hayash S., Ozawa T., KatsumataY., 1999. Purification of nuclear DNA from single hair shafts for DNA analysis in forensic sciences. Legal Med. 1: 61 – 67.
13. Rees J. L., 2003. Genetics of hair and skin colour. Annu. Rev. Genet. 37: 67 – 90.
14. Sake R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985. Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science. 230,1350 – 1355.
15. Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G. I., 2000. Ful flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the good assay. Nucleic Acids Research. 28: 23.
16. Schnabel R. D., Ward T. J., Derr J. N., 2000. Validation of 15 microsatellites for parentage testing in North American bison, Bison bison and domestic cattle.
Animal Genetics. 31: 360 – 366.
17. Vigilant L., 1999. An evaluation of techniques for the extraction and amplification of DNA from naturally shed hairs. Bio. Chem. 390 : 1329 – 1321.
18. Wagner M, Bailey D.G.,1993. Structure of bovine and hair root-A scanning electron microscope investigation. Superior systems service. 13: 61 – 78.
28
PHỤ LỤC
* Hoá chất dùng trong đề tài - Hoá chất ly trích DNA KCl 500 mM NaCl 20 mM Tris HCl pH 8 50 mM, 100 mM SDS 1% + Proteinase K 0,5 mg/ml
+ Phenol: chloroform: isoamy alcohol 25:24:1
+ TE buffer 1X Tris HCl 100 mM EDTA( pH 8) 1 mM + Ethanol 70%; 95% + Tris base (pH 8) 2 M + Sodium acetate 0,2 M; 2 M + DTT 70 mM + CTAB 0,06%, 0,2% - Hoá chất phản ứng PCR PCR buffer 1 X MgCl2 2 mM Mỗi dNTP 200 µM Mồi xuôi 0,5 µM Mồi ngƣợc 0,5 µM
Taq DNA polymerase 1 UI
- Hoá chất chạy điện di sản phẩm PCR