2.2.1. Hoá chất
Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Dung môi được sử dụng là: hexan, metanol, butanol, etylaxetat, axeton, clorofom,0..
nước cất.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3.
Phổ khối lượng EI-MS được ghi trên máy HP 5989 B-MS với năng lượng bắn phá ở 70 eV và phổ ESI-MS đo trên máy LC-MS-Trap-00127.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY, NOESY được đo trên máy Bruker 125 MHz. Với tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero (δ = 0). Độ chuyển dịch hoá học δ được biểu thị bằng ppm. Tính bội của các tín hiệu 13C được xác định trên cơ sở các phổ DEPT 90 và DEPT 135.
2.3. Nghiên cứu các hợp chất 2.3.1. Thu mẫu
Mẫu Nigrofomes melannoporus được thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Mát- Nghệ An vào tháng 11/2009, được TS Ngô Anh (thuộc khoa Sinh, trường Đại học Huế) định danh, tiêu bản (Vin- TSWu-200901) được lưu giữ tại khoa Sinh, Đại học Vinh.
2.3.2. Phân lập các hợp chất
Mẫu nấm phơi khô (1350 g) được ngâm ba lần với dung môi clorofom- metanol (1:1, v/v) ở nhiệt độ thường. Sau khi cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không các dịch chiết thu được cặn chiết với khối lượng 78 g (cao tổng). Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần.
Lượng căn chiết này được sắc ký cột silica gel (1 kg, 80 × 8 cm) với hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton (100:0, 50:1, 20:1, 10:1, 2:1, 1:1 mỗi hệ dung môi sử dụng 1 lít) thu được 10 phân đoạn.
Bảng 2.1. Hệ dung môi rửa giải sắc ký cột cao tổng
Số thứ tự Hệ dung môi Tỉ lệ Phân đoạn
1 Hexan:axeton 100:0 F1
3 Hexan:axeton 50:1 F3 4 Hexan:axeton 30:1 F4 5 Hexan:axeton 20:1 F5 6 Hexan:axeton 15:1 F6 7 Hexan:axeton 9:1 F7 8 Hexan:axeton 4:1 F8 9 Hexan:axeton 2:1 F9 10 Hexan:axeton 1:1 F10
Phân đoạn F2 có khối lượng 2,4 g được tiến hành sắc ký silica gel lần thứ hai với loại cột nhỏ (200 g, 40 × 5 cm), hệ dung môi rửa giải hexan-axeton (100:0, 50:1, 10:1, 2:1, 1:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 250mL) thu được 5 phân đoạn. Phân đoạn F2-3 ( 85 mg) được tách bằng sắc ký cột được chất A (12 mg) và B (17 mg). Phân đoạn F2-5 được tách bằng sắc ký cột được chất C (37 mg)
Bảng 2.2. Hệ dung môi rửa giải sắc ký cột phân đoạn F2
Phân lập và tinh chế các chất từ nấm Nigrofomes melannoporus được thực
hiện theo sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1: Phân lập hợp chất trong nấm Nigrofomes melannoporus
Hợp chất A: Chất bột không màu, IR (KBr) νmax (cm-1): 3354, 1673. Phổ 1H- NMR (400MHz, CDCl3) (δ ppm): 7,63 (1H,d, J =20 Hz, H-7); 7,56 (2H, dd, J =6 Hz, H2, 6); 6,90 (2H, dd, J = 6 Hz, H-3, 5); 6,35 (1H, d, J = 20 Hz, H-8.
Số thứ tự Hệ dung môi Tỉ lệ Phân đoạn
1 Hexan:axeton 100:0 F2-1 2 Hexan:axeton 50:1 F2-2 3 Hexan:axeton 30:1 F2-3 4 Hexan:axeton 20:1 F2-4 5 Hexan:axeton 10:1 F2-5 1350 g Mẫu khô
ngâm chiết với MeOH
F1 F2 2.4 g F3 F4 F5 F6 Cao MeOH (78g) F7 F8 F9 F10 Hexan-axeton (100:0 - 1:1) CM (100:0 - 10:1) A B C F2-1 F2-2 F2-3 (85 mg) F2-4 F2-5
Hợp chất B: Chất keo không màu đ.n.c: 165-1670C. Phổ UV (MeOH) λmax
nm: 211, 285. IR (KBr) νmax (cm-1):3406, 1711. Phổ 1H-NMR (400MHz, CDCl3) (δ ppm): 7,64 (1H, d, J =19,9 Hz, H-7); 7,08 (1H, dd, J =10,3 Hz, H-6); 7,03 (1H, d, H-2); 6,93 (1H, d, J = 13,2 Hz, H-5); 6,30 (3H, d, J = 19,9 Hz, H-8); 3,95(3H, s, OCH3); 3,79 (3H, s, COOCH3).
Hợp chất C: Chất bột màu trắng, đ.n.c: 165-1670C. Phổ UV (Me-OH) λmax
nm: 211, 285. IR (KBr) νmax (cm-1): 3433, 2959, 1726, 1090. Phổ EI-MS m/z 396 [M]+. Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) (δ ppm): 5,49 (1H, m); 5,35 (1H, m); 5,28 (1H, dd, J = 15,5, 7,5 Hz); 5,25 (1H, dd, J = 15,5, 7,0 Hz); 3,48 (1H, m); 1,05 (3H, d, J = 7,0 Hz); 0,96 (3H, s); 0,93 (3H, d, J = 7,0 Hz); 0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz); 0,82 (3H, d, J = 6,5 Hz); 0,61 (3H, s). Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) (δ ppm): xem bảng 3.1. Chương 3
3.1. Phân lập các hợp chất
Quả thể nấm N. melanoporus phơi khô (1350 g) được chiết với hỗn hợp dung môi MeOH:CHCl3 ở nhiệt độ thường thu được cặn chiết với khối lượng 78 g (cao tổng). Lượng căn chiết này được sắc ký trên cột silicagel tách được các chất A, B và C.