Tách chiết ADN tổng số từ lá non của 80 dòng ngô HR8 chuyển gen tái sinh và tiến hành phân tích PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu T5, T6; T7,
T8, và T9, T10 đã đ−ợc thiết kế để có thể nhân đoạn ADN có độ dài 1231
bp từ gen gus, 550 bp từ gen nptII và 224 bp từ gen vir.
Kết quả phân tích PCR cho thấy, tất cả 80 dòng ngô HR8 chuyển gen tái sinh đều không mang gen vir (hình 3.34), trong số đó chúng tôi thu đ−ợc 15 dòng có kết quả d−ơng tính: 3 dòng mang gen gus (hình 3.32), 8 dòng với sự có mặt của gen nptII (hình 3.33), và 4 dòng mang cả gen nptII và gen gus.
Hình 3.32. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đ−ợc chuyển gen gus
1231bp
Hình 3. 33. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đ−ợc chuyển gen nptII
550bp
Hình 3.34. Kết quả phân tích PCR
các dòng ngô HR8 đã đ−ợc chuyển
gen thông qua A. tumefaciens (kiểm tra sự có mặt của gen vir)
Các dòng ngô HR8 mang gen nptII này đ−ợc chuyển ra đất trồng đều biểu hiện kiểu hình bình th−ờng, hữu thụ và thu nhận hạt R1.
3.5. So sánh hiệu quả chuyển gen giữa ph−ơng pháp biến nạp
bằng súng bắn gen vμ thông qua A. tumefaciens
Trên cơ sở kết quả thu đ−ợc của những nghiên cứu tạo dòng ngô chuyển
gen bền vững, hiệu quả chuyển gen giữa ph−ơng pháp biến nạp bằng súng
bắn gen và A. tumefaciens đã đ−ợc so sánh nhằm xác định đ−ợc ph−ơng pháp chuyển gen thích hợp vào phôi non ở cây ngô (bảng 3.28).
Bảng 3.28. So sánh hiệu quả chuyển gen vào phôi non dòng ngô HR8 bằng ph−ơng pháp súng bắn gen và thông qua A. tumefaciens
Ph−ơng pháp áp dụng Số thí nghiệm Số phôi lây nhiễm Số cây tái sinh Số cây chuyển gen STF (%) Số cây hữu thụ A. tumefaciens 7 955 80 15 1,6 12/12 Bắn gen 6 830 71 12 1,4 8/10
Để áp dụng công nghệ chuyển gen vào việc tạo ra các giống ngô mang các đặc tính mới có thể sử dụng trong chọn tạo giống, chúng tôi thấy rằng ph−ơng pháp biến nạp thông qua A. tumefaciens có hiệu quả hơn so với bắn gen cả về lý thuyết và giá trị thực tiễn.
Ch−ơng 4.kết luận vμ Đề nghị
Kết luận
1. Đã cải tiến và hoàn thiện quy trình tái sinh cây từ phôi non dòng
ngô HR8 nh− sau: phôi non kích th−ớc 1-2 mm nuôi cấy trên môi tr−ờng có thành phần khoáng và vitamin cơ bản N6 bổ sung 20 g/l sucrose, 10 g/l
glucose, 2 mg/l 2,4-D, 10 mg/l AgNO3, 100 mg/l casein hydrolysat, 25
mM L-proline và 3 g/l phytagel. Quy trình này có thể áp dụng đ−ợc với các dòng/giống ngô khác nhau trong điều kiện Việt Nam, cho hiệu quả tái sinh cao.
2. Đã tạo ra 5 dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh tốt bằng ph−ơng pháp lai hữu tính kết hợp với tái sinh in vitro. Cảm ứng tái sinh đã đ−ợc truyền từ dòng ngô tái sinh cao (HR8) sang 5 dòng ngô Việt Nam, tạo
ra các dòng BC2FN: GAB, GA35, GCA8, GH35 và GCH8. Các dòng ngô
BC2FN này có khả năng tái sinh tốt, thích ứng với điều kiện tự nhiên Việt Nam.
3. Quy trình chuyển gen vào phôi non dòng ngô HR8 bằng súng bắn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gen đã đ−ợc cải tiến và hoàn thiện với các thông số bắn gen tối −u: mô đích tiền nuôi cấy 5 ngày và đ−ợc xử lý áp suất thẩm thấu 5 giờ tr−ớc và 20 giờ sau khi bắn, khoảng cách từ màng nổ tới mô đích 9 cm, áp lực bắn 1350
psi, vectơ mang gen đ−ợc điều khiển bởi đoạn khởi động Ubi, 80 μg hạt
vàng kích th−ớc 0,6 àm. Đã tạo ra đ−ợc 10 dòng ngô HR8 mang gen kháng
thuốc diệt cỏ basta (pat), thu nhận hạt chuyển gen thế hệ R1 và sử dụng
làm nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu chọn tạo giống ngô.
4. Đã xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen vào phôi ngô non
nhờ A. tumefaciens. Phôi non dòng ngô HR8 có kích th−ớc 1-1,5 mm ngay
sau khi tách đ−ợc lây nhiễm với chủng vi khuẩn ATHV mang vectơ
pBINGUSINT chứa gen gus và nptII và nuôi cấy cộng sinh trên môi tr−ờng có bổ sung 200 mM AS đã cho hiệu quả biến nạp gen cao nhất. Đã tạo
đ−ợc 12 dòng ngô HR8 mang gen nptII có khả năng kháng kanamycin, thu
nhận hạt ngô chuyển gen thế hệ R1.
5. Đã xác định đ−ợc ph−ơng pháp biến nạp gen thông qua A.
tumefaciens vào phôi ngô non có hiệu quả hơn so với ph−ơng pháp bắn gen cả về lý thuyết và thực tiễn. Ph−ơng pháp này sẽ đ−ợc áp dụng để chuyển các gen có giá trị kinh tế vào các dòng/giống ngô.
Đề nghị
1. Tiếp tục nghiên cứu các dòng ngô HR8 chuyển gen mới tạo đ−ợc. Đánh
giá sự biểu hiện, tính ổn định và di truyền của gen chuyển nạp qua tự phối và lai.
2. Nghiên cứu áp dụng các quy trình tái sinh và biến nạp đã xây dựng