2015
Trong quá trình kiểm tra ELISA trên các mẫu dưa chuột vụ Đông năm 2014 và các mẫu bí ngô, dưa chuột vụ Xuân hè năm 2015 mới chỉ phát hiện được các potyvirrus gây bệnh trên cây bầu bí, chưa phát hiện được các bogomovirrus gây bệnh trên cây bầu bí.
Tại miền Bắc Việt Nam, đã có ít nhất 1 begomovirus được phát hiện thấy trên cây bầu bí là Squash leaf curl China virus (SqLCCNV) (Revill et al., 2003). Mục tiêu của nghiên cứu này là phát hiện begomovirus bằng PCR dùng mồi đặc hiệu cho begomovirus (cặp mồi BegoAFor1/BegoARev1) trên các mẫu cây bầu bí thu thập được có biểu hiện triệu chứng bệnh virus.
Bảng 4.12. Kiểm tra PCR các mẫu thu thập từ khu ruộng thí nghiệm khoa Nông học năm 2014 và 2015
ST
T Mẫu Giống Triệu chứng Năm
PCR BegoAFor1/
BegoARev1
Krusty & Homer
1 M1 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 - -
2 M2 Dưa chuột khảm nhăn + biến dạng
+biến vàng 2014 - -
3 M3 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 - -
4 M4 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 - -
5 M5 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 - -
6 M6 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 - -
7 M7 Dưa chuột Khảm biến vàng 2014 - -
8 M8 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - +
9 M9 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - +
10 M10 Bí ngô Đốm biến vàng 2015 - +
11 M11 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - + 12 M12 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - + 13 M13 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - + 14 M14 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - +
15 M15 Bí ngô Khảm biến vàng 2015 - +
16 M16 Bí ngô Khảm nhăn + đốm biến
vàng 2015 - +
17 M17 Bí ngô Khảm nhăn + đốm biến
vàng 2015 - +
18 M18 Bí ngô Khảm biến vàng 2015 - +
19 M19 Bí ngô Khảm nhăn + biến vàng 2015 - +
20 M20 Bí ngô Khảm biến vàng 2015 - +
21 M21 Dưa chuột Khảm đốm biến vàng 2015 - - 22 M22 Dưa chuột Khảm nhăn + biến dạng 2015 - +
23 M23 Dưa chuột khảm biến dạng 2015 - +
24 M24 Dưa chuột Khảm nhăn 2015 - -
25 M25 Dưa chuột Khảm 2015 - -
26 M26 Dưa chuột Khảm biến dạng 2015 - +
27 M27 Dưa chuột Khảm 2015 - +
28 M28 Dưa chuột Khảm 2015 - -
29 M29 Dưa chuột Khảm nhăn + biến dạng 2015 - -
Hình 4.19. Kết quả PCR phát hiện begomovirus (cặp mồi Krusty & Homer) trên 30 mẫu bầu bí thu tại Gia Lâm năm 2014 và 2015 (thứ tự mẫu trình bày ở bảng 4.12). M là thang DNA (Genruler 1 Kb, hãng Fermentas) với
băng tham khảo 1 kb . Ca là mẫu cà chua thu tại nhà lưới Trung tâm bệnh cây nhiệt đới- HVNNVN, N là mẫu nước cất làm đối chứng.
Kết quả PCR cho thấy tất cả 30 mẫu dưa chuột và bí ngô biểu hiện các triệu chứng bệnh virus đều có phản ứng PCR âm tính với cặp mồi đặc hiệu begomovirus (cặp mồi BegoAFor1/BegoARev1).
Qua kiểm tra mồi BegoARev1 không thể bắt cặp được với DNA của SLCCNV vì trong trình tự ở vị trí 3’ của SLCCNV là AA còn của mồi là CC. Vì thế cặp mồi BegoAFor1/BegoARev1 không thế phát hiện được SLCCNV có trong các mẫu thu thập.
Tiến hành kiểm tra PCR bằng cặp mồi đặc hiệu phát hiện các begomovirus (DNA – A) là Krusty & Homer kích thước khoảng 600 bp. Kết quả cho thấy 17/30 mẫu có phản ứng dương tính với mồi đặc hiệu Krusty & Homer.
Qua kết quả PCR (bảng 4.12) có 13 mẫu bí ngô và 4 mẫu dưa chuột nhiễm các begomovirus, như vậy đánh giá tính kháng PRSV ngoài tự nhiên trên tập đoàn giống dưa chuột khá chính xác, còn đánh giá trên tập đoàn giống bí ngô phức tạp hơn vì tỷ lệ nhiều begomovirustreen bí ngô rất cao và ảnh hưởng nhiều đến biểu hiện triệu chứng do PRSV gây ra.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ca 10 11 12 13 14 15 16 N
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu bệnh khảm lá papaya ringspot virus (PRSV) trên cây họ bầu bí tại Huyện Gia Lâm vụ Đông năm 2014 và vụ Xuân hè năm 2015 chúng tối có một số kết luận sau :
1. Điều tra đồng ruộng trên các ruộng bầu bí tại khu vực Gia Lâm Vụ Đông 2014 đã phát hiện 4 bệnh chính gồm bệnh biến vàng (do virus), bệnh khảm nhăn (do virus), bệnh phấn trắng (nấm ) và bệnh sương mai (nấm).
2. Điều tra định kì bệnh virus trên tập đoàn 46 giống dưa chuột của bộ môn Rau Hoa Qủa trồng tại khoa Nông học , vụ Đông 2014 đã xác định được 4 giống có tiềm năng kháng bệnh khảm lá Papaya ringspot virus là là HB1, LCH3b, SL29g và SL27b.
3. Điều tra định kì bệnh virus trên tập đoàn 47 giống dưa chuột của bộ môn Rau Hoa Qủa trồng tại khoa Nông học , vụ Xuân hè 2015 đã xác định được 3 giống có tiềm năng kháng bệnh khảm lá PRSV là NEP1, THI và LCH3b.
4. So sánh các giống tiềm năng kháng qua 2 vụ Đông 2014 và vụ Xuân hè 2015 cho thấy giống LCH3b có tiềm năng kháng với virus PRSV.
5. Kiểm tra ELISA đã xác định được thành phần virus trên cây bầu bí tại Gia Lâm năm 2014-2015 gồm 3 virus là PRSV, CMV, ZYMV, trong đó virus PRSV là nguyên nhân chính gây nên các triệu chứng bệnh virus.
6. Kiểm tra PCR đã xác định được trên các tập đoàn giống bí ngô và dưa chuột ngoài các potyvirus còn có các begomovirus gây bệnh khảm lá.
7. Đánh giá tính kháng bệnh khảm lá PRSV trên 4 giống có tiềm năng kháng (SL29g, SL27b, LCH3b và HB1) bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo cây con trong nhà lưới chống côn trùng đã xác định được giống LCH3b có tính kháng với PRSV. Ngoài ra qua kết quả đánh giá tính kháng trong nhà lưới thấy giống đối chứng kháng Nhật T1-126 có biểu hiện tính kháng PRSV khá tốt.
5.2 Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu về tính kháng bệnh khảm lá Papaya ringspot virus trên bầu bí.
PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Cục BVTV (1997), Phương pháp điều tra và phát hiện bệnh hại cây trồng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
2. Hà Viết Cường (2008), Giáo trình dịch bệnh cây, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Hà Viết Cường (2008), Giáo trình miễn dịch thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
4. Hà Viết Cường, Trần Thị Như Hoa, Vũ Triệu Mân, Peter Revill, James Dale, Phát hiện virus gây bệnh trên cây bầu bí ở Việt Nam, Detection of viruses Infecting Cucurbits in Viet Nam, Hội thảo bệnh cây và sinh học phân tử, 2002, tr. 26-28.
5. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998), Giáo trình bệnh cây Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
6. Vũ Triệu Mân (1995), Một số bệnh virus hại cây họ bầu bí ở vùng đồng bằng sông hồng miền bắc Việt Nam, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 5, Tr 30- 33.
7. Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật, NXB Nông Nghiệp.
8. Vũ Hồng Xa (2002), Điều tra thành phần bệnh virus hại cây họ bầu bí và một nghiên cứu về SqLCV tại Gia Lâm –Hà Nội vụ xuân hè 2002. Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp, Đại học nông nghiệp, Hà Nội.
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo nhiệt tình, chu đáo của các thầy, cô giáo và các cá nhân tập thể.
Trước hết tôi xin bày tỏ sự cảm ơn trân trọng nhất tới thầy TS. Hà Viết Cường - Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới - Phó trưởng khoa Nông học - Học viện nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Học viện nông nghiệp Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn bệnh cây cùng các thầy cô giáo trong khoa Nông học - Học viện nông nghiệp Việt Nam đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích, những góp ý chân thành giúp tôi hoàn thiện báo cáo. Cám ơn các bạn cùng tham gia làm đề tài khoa học đã hỗ trợ tôi trong những lúc cần thiết.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, những người thân và bạn bè đã tạo điều kiện về mọi mặt cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài này.
Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2015
Sinh viên
MỤC LỤC
PHẦN I. MỞ ĐẦU...1
1.1 Đặt vấn đề...1
1.2 Mục đích...2
1.3 Yêu cầu...2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...3
2.1 Đặc điểm chung chi Potyvirus...3
2.1.1 Phân loại...3
2.1.2 Đặc điểm phân tử virus (virion) ...4
2.1.3 Lan truyền ...5
2.1.4 Cách chẩn đoán và xác định Potyvirus ...5
2.2 Giới thiệu về Papaya ringspot virus...5
2.2.1 Phân loại ...5
2.2.2 Môi giới truyền bệnh ...6
2.2.3 Triệu chứng ...6
2.2.4 Biện pháp phòng chống...6
2.3 Nguồn gốc xuất xứ và tình hình sản xuất cây họ bầu bí...7
2.3.1 Thành phần bệnh virus trên cây họ bầu bí...8
2.3.2 Tình hình sản xuất bầu bí ở Việt Nam...10
2.3.3 Những nghiên cứu về bệnh virus trên cây họ bầu bí ở Việt Nam...11
2.4 Tính kháng bệnh virus PRSV trên cây họ bầu bí...12
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...12
3.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu...12
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu...12
3.1.2 Thời gian nghiên cứu...12
3.1.3 Địa điểm điều tra xác định thành phần bệnh...13
3.2 Vật liệu nghiên cứu...13
3.2.1 Thiết bị nghiên cứu...13
3.2.2 Dụng cụ nghiên cứu...13
3.2.3 Hoá chất...13
3.3 Phương pháp nghiên cứu...14
3.3.1 Điều tra đồng ruộng...14
3.3.2 Đánh giá tính kháng trong kiện đồng ruộng...14
3.3.3 Đánh giá tính kháng trong điều kiện nhà lưới...16
3.3.4 Phương pháp kiểm tra ELISA gián tiếp phát hiện PRSV, ZYMV, CMV...17
3.3.5 Phương pháp kiểm tra PCR...19
3.3.6 Phương pháp tính và xử lý số liệu ...20
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...22
4.1 Điều tra thành phần bệnh hại trên cây bầu bí tại huyện Gia Lâm vụ xuân hè 2015...22
4.2 Đánh giá tính kháng đồng ruộng đối với virus PRSV của tập đoàn giống dưa chuột trồng tại khoa Nông học vụ đông năm 2014...24
4.2.1 Xác định bệnh virus chính trên tập đoàn giống dưa chuột vụ đông 2014 bằng phương pháp ELISA 24 4.2.2 Đánh giá tính kháng PRSV trên tập đoàn giống dưa chuột thí nghiệm vụ đông 2014 ...27
4.3 Đánh giá tính kháng đồng ruộng đối với virus PRSV của tập đoàn giống dưa chuột trồng tại khoa Nông học vụ xuân hè năm 2015...31 4.3.1 Xác định bệnh virus chính trên tập đoàn giống dưa chuột vụ xuân hè 2015 bằng phương pháp ELISA 31
4.3.2 Đánh giá tính kháng PRSV trên tập đoàn giống dưa chuột thí nghiệm vụ xuân hè 201535 4.4 Đánh giá tính kháng trên đồng ruộng đối với bệnh virus của tập đoàn giống bí ngô trồng
tại khoa Nông học vụ xuân hè 2015 ...37
4.4.1 Xác định bệnh virus chính trên tập đoàn giống bí ngô vụ xuân hè 2015 bằng phương pháp ELISA 37 4.5 Đánh giá tính kháng PRSV của một số giống dưa chuột tiềm năng kháng trong điều kiện nhà lưới 43 4.5.1 Kiểm tra virus PRSV các mẫu nguồn trước lây nhiễm bằng phương pháp ELISA...43
4.5.2 Kết quả lây nhiễm nhân tạo PRSV trên các giống dưa chuột tiềm năng kháng...44
4.5.3 Kiểm tra ELISA tất các cây sau 4 tuần lây nhiễm...46
4.6 PCR phát hiện bogomovirus trên cây bầu bí thu thập được năm 2014 và 2015...49
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...52
5.1 Kết luận...52
5.2 Kiến nghị...52
PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO...53
Tài liệu tiếng việt...53
Tài liệu tiếng anh...53
LỜI CẢM ƠN...i
MỤC LỤC...ii
DANH MỤC BẢNG...iv
DANH MỤC HÌNH...v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Phân loại họ Potyviridae ...4
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất dưa chuột của một số nước trên thế giới ...7
qua các năm 2006, 2007...7
Bảng 2.3. Thành phần bệnh virus gây hại trên bầu bí đã được xác định ...10
trên thế giới ...10
Bảng 2.4. Diện tích, năng suất và sản lượng một số loại rau chủ lực năm 2004 ...11
Bảng 2.5: Mức độ phổ biến của những loài virus trên cây trông họ bầu bí ...11
Bảng 3.1. Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu...19
Bảng 4.1. Tình hình bệnh hại bầu bí một số xã tại huyện Gia Lâm ...22
vụ xuân hè 2015...22
Bảng 4.2. Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV đối với các mẫu dưa chuột thu tại ruộng thí nghiệm trông vụ đông 2014...25
Bảng 4.3. Đánh giá tính kháng PRSV của các dòng dưa chuột trồng vụ ...27
đông 2014 (Chỉ trình bày số liệu 2 lần điều tra cuối)...27
Bảng 4.4. Chỉ số tích lũy bệnh khảm lá PRSV theo thời gian (AUDPC) của tâp đoàn giống dưa chuột trồng tại ruộng thí nghiệm khoa Nông học vụ đông 2014...30
Bảng 4.5. Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV đối với các ...33
mẫu dưa chuột thu tại ruộng thí nghiệm trông vụ xuân hè 2015...33
Bảng 4.6. Đánh giá tính kháng PRSV của các dòng dưa chuột trồng ...36
vụ xuân hè 2015 (Chỉ trình bày số liệu 2 lần điều tra cuối)...36
Bảng 4.7. Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV đối với ...38
các mẫu bí ngô thu tại ruộng thí nghiệm trông vụ xuân hè 2015 (lần 1- 28/5)38 Bảng 4.8. Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV đối với các mẫu bí ngô thu tại ruộng thí nghiệm trông vụ xuân hè 2015 (lần 2- 17/6)...40
Bảng 4.9. Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV đối với các mẫu mẫu bí ngô trước lây nhiễm...43
Bảng 4.10. Đánh giá tính kháng PRSV trên tập đoàn giống dưa chuột tiềm năng kháng...46
Bảng 4.11. Kiểm tra ELISA virus PRSV trên các cây lây nhiễm...47
Bảng 4.12. Kiểm tra PCR các mẫu thu thập từ khu ruộng thí nghiệm...49
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Hình thái virion của potyvirus...4 Hình 2.2. Tổ chức bộ gen của các potyvirus ...5 Hình 4.1 Một số bệnh gây hại trên cây họ bầu bí tại Gia Lâm...23 Hình 4.2. Triệu chứng bệnh virus điển hình trên ruộng dưa chuột thí nghiệm vụ đông 2014...25 Hình 4.3. Các mẫu dưa chuột thu trên ruộng thí nghiệm vụ đông 2014 được kiểm tra ELISA...26 Hình 4.4. Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu dưa chuột thu tại ruộng thí nghiệm vụ đông 2014...27 Hình 4.6. Triệu chứng bệnh virus điển hình trên ruộng dưa chuột ...32 thí nghiệm vụ xuân hè 2015...32 Hình 4.7. Các mẫu dưa chuột thu trên ruộng thí nghiệm vụ xuân hè 2015 được kiểm tra ELISA...34 Hình 4.8. Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu dưa chuột thu tại ruộng thí nghiệm vụ xuân hè 2015...34 Hình 4.9. Tập đoàn giống bí ngô 1 tháng sau gieo tại khu ruộng ...37 thí nghiệm khoa Nông học vụ xuân hè 2015...37 Hình 4.10. Triệu chứng bệnh virus điển hình trên ruộng bí ngô thí nghiệm vụ xuân hè 2015...38 Hình 4.11. Các mẫu bí ngô thu trên ruộng thí nghiệm vụ xuân hè 2015 được kiểm tra ELISA (lần 1)...40 Hình 4.12. Các mẫu bí ngô thu trên ruộng thí nghiệm vụ xuân hè 2015 được kiểm tra ELISA (lần 2)...42 Hình 4.13. Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu bí ngô thu tại ruộng thí nghiệm vụ xuân hè 2015...42 Hình 4.14 Kiểm tra ELISA phát hiện PRSV, ZYMV và CMV trên các mẫu bí ngô trước lây nhiễm...44 Hình 4.15. Cây nguồn được đánh dấu và mẫu trước khi lây nhiễm...45 Hình 4.16. Dịch cây bệnh, dụng cụ và các chậu cây dưa chuột tiến hành lây nhiễm bằng tiếp xúc cơ học...45 Hình 4.17. Bố trí thí nghiệm trong nhà lưới chống côn trùng...46 Hình 4.18. Kiểm tra ELISA các cây lây nhiễm PRSV trong nhà lưới...47 Hình 4.19. Kết quả PCR phát hiện begomovirus (cặp mồi Krusty & Homer) trên 30 mẫu bầu bí thu tại Gia Lâm năm 2014 và 2015 (thứ tự mẫu trình bày ở bảng 4.12). M là thang DNA (Genruler 1 Kb, hãng Fermentas) với băng tham khảo 1 kb . Ca là mẫu cà chua thu tại nhà lưới Trung tâm bệnh cây nhiệt đới- HVNNVN, N là mẫu nước cất làm đối chứng...51
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Từ viết vắt 1 BVTV Bảo vệ thực vật