2.2.1.1. Điểu chế chitin
- Chuẩn bị nguyên liệu: Mai mực ống phơi khô, loại bỏ tạp chất, bẻ nhỏ đến kích thước trung bình khoảng 2x2 cm.
- Loại muối khoáng và protein: Cân lkg mai mực đã bẻ nhỏ cho vào 10 lít dung dịch HC1 IN, ngâm trong 48 giờ, sau đó rủa sạch bằng nước cất đến pH ~ 7 thu được nguyên liệu đã tách khoáng. Ngâm nguyên liệu đã được tách khoáng trong dung dịch kiềm 10% trong 48 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất đến pH ~ 7. Lặp lại quá trình trên 2 lần để loại bỏ hết muối khoáng và protein. Phơi khô sản phẩm ở nhiệt độ phòng, sau đó sấy khô chân không ở nhiệt độ 60°c đến khối lượng không đổi thu đước chitin màu trắng, xốp, không tan trong nước.
Bảng 2.1: Thành phần chính của một số nguyên liệu chứa chitỉn
Nguyên ỉiệu Chitin (ỉoại) (%) Muối khoáng (%) Protein (% )
Vỏ tôm khô 1 5 - 2 0 (a) 4 0 - 5 0 3 0 - 4 0
Mai mực ống 3 0 - 4 0 (P) Rất ít = 60
- Hiệu suất tách chitin được tính theo công thức Ị2.1 Ị.
vu
< W % ) = ^ ^ x i o o % (2.1)
ỉtlnguyenỉieu
Trong đó: ^chít in là hàm lượng chitin có trong mẫu nguyên liệu (%) mchitin là khối lượng sản phẩm chitin thu được (g) mnguyên liệu là khối lượng nguyên liệu ban đầu 2.2.1.2. Điều chế chỉtosan
- Điều chế chitosan theo phương pháp kiềm đặc kết họp nhiệt độ cao: Cân 35g chitin cho vào bình cầu đã chứa dung dịch NaOH 50% ở 100 -ỉ- 120°c, khuấy trên máy khuấy từ liên tục trong 12 giờ. Lọc, rửa mẫu nhiều lần bằng nước cất đến pH ~ 7 thu được chitosan màu trắng, tan trong môi trường axit axetic 1 %. Tiến hành phản ứng lặp lại để thu được chitosan có độ axetyl hóa thấp (DA <10%).
Điều chế chitosan theo phương pháp phá kết tinh: Hòa tan hoàn toàn 5g chitosan thu được ở trên (theo phương pháp kiềm đặc kết hợp nhiệt độ cao) trong dung dịch axit axetic 1% để qua đêm sau đó lọc bỏ phần không tan. Tiếp đó cho vào dung dịch chitosan này lượng NaOH rắn để đạt nồng độ 5% và tiến hành phản ứng deaxetyl hóa ở 100°c trong khoảng thời gian 3 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, tiến hành lọc và rửa sản phẩm nhiều lần bằng nước cất cho đến pH ~ 7 thu được chitosan sạch.
G,(%)= — xioo (2.2)
mD
Trong đó: m là khối luợng sản phẩm phản ứng deaxetyl hóa (g) m0 là khối lượng của chitin ban đầu (g)
2.2.1.3. Xác định độ axetyl hóa /deaxetyl hóa
- Dựa vào phổ IR độ axetyl hóa DA của chitin/chitosan được xác định theo công thức {2.3} của Robert:
———■ X 115
A
3450
A1655 là diện tích pic hấp thụ ở 1655 cm '1 (vc=o) A3450 là diện tích píc hấp thụ ở 3450 cm' 1 (voh)
- Dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân, độ axetyl hóa của mẫu chitosan tĩnh theo công thức {2.4}:
DA=IcH3/3(Ihi chitosan+Im chitin)x 100% { 2.4 } (trong đó I là giá trị tích phân của các pic tín hiệu)
2.2.1.4. Xác định khối lượng phân tử trung bình số của chitosan
Phương pháp đo áp suất thẩm thấu là phương pháp dựa trên định luật Vant-Hoff. Theo định luật này, sự phụ thuộc giữa áp suất thẩm thấu p, thể tích V, nhiệt độ tuyệt đối T và số gam phân tử của vật chất trong dung dịch pha loãng được biểu diễn bằng phương trình trùng với dạng phương trình của dạng khí lý tưởng.
Khối lượng phân tử trung bình của chitosan được xác định như sau: Pha dung dịch chitosan có nồng độ lần lượt: 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 (g/lOOml) trong dung môi axit axetic 1% ở nhiệt độ 35°c. Lập bảng giá trị sự phụ thuộc của áp suất thẩm thấu (ri) vào nồng độ (C), xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc của n / c vào c đế tìm giá trị ngoại suy của n / c khi C—»0. Thay vào phương trình {2.5} để tính toán được khối lượng phân tử trung bình số.
V ^ /C-» 0 Trong đó: II: áp suất thẩm thấu
— _ 848.(7 + 273)
T n — — í2 -5 ì
^ -D,
c dm
M n : khối lượng phân tử trung bình số 848: hằng số
T: nhiệt độ đo C: nồng độ chitosan
n / c (C—>0): giá trị ngoại suy của n / c khi C—>0 Ddm- tỷ trọng của dung môi
2.2.2. Điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp (LWC)
2.2.2.1. Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp
Quá trình đề polyme hóa P-chitosan thành Ị3-chitosan khối lượng phân tử thấp dựa trên nguyên tắc dùng axit HC1 kết họp với nhiệt để cắt đứt liên kết P(l-4) glucozit trong mạch chitosan. Phản ứng xảy ra theo sơ đồ sau:
2.22.2. Khảo sát phản ứng với điều kiện thí nghiệm khác nhau
2.2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axít HC1 đến khối lượng phân tử trung bình (M J của chỉtosan trọng lượng phân tử thấp (LWC)
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ axit tới khả năng phản ứng đề polyme hóa chitosan (sử dụng hai loại chitosan có độ đề axetyl hóa trung bình và độ đề axetyl hóa cao thu được ở trên), tiến hành thực hiện phản ứng cắt mạch sử dụng các dung dịch axit có nồng độ khác nhau: 0,1; 0,5; 1,0 ; 1,5 và 2,0N ở 80°c, thời gian 12 giờ.
2.2.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng cùa nhiệt độ phản ứng đến khối lượng phân tử trung bình (m„ ) của chỉtosan khối lưọng phân tử thấp (LWC)
Đe polyme hóa 8 mẫu chitosan với nồng độ axit HC1 là IN và thời gian phản ứng 12 giờ, nhiệt độ phản ứng (T°pư) lần lượt là 30°c, 40°c, 50°c, 60°c, 70°c, 80°c, 90°c và 100°c, các mẫu ký hiệu lần lượt là p,, p2, p3, p4, p5, p6,
p7, p8 Qúa trình tiến hành tương tự như trong mục 2.2.2.1.
2.2.2.2.3. Khảo sát tính tan trong nước của chỉtosan trọng lượng
phân tử thấp (LWC)
Hoà tan các sản phẩm chitosan trọng lượng phân tử thấp vào nước cất. Lọc dung dịch qua màng lọc xenlulo nitrate để loại bỏ phần không tan. Dung dịch thu được trong suốt, làm khô và cân phần không tan. Xác định lượng chitosan tan trong nước.
Ịfl
Đ T p (% )= — x l00%
m bd
m, là khối lượng chitosan trọng lượng phân tủ' thấp tan trong nước.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điều chế chitin/chitosan
3.1.1. Điều chế chitin
Ị3-chitin được tách từ mai mực theo quy trình thực nghiệm 2.2.1.1 có màu trắng, xốp, không tan trong nước. Hàm lượng P-chitin chiếm ~ 37,5% (bảng 3.1). Ket quả này phù họp với số liệu được công bố: hàm lượng chitin trong mai mực ống từ 30 - 40%
Bảng 3.1: Hàm ỉưọng P-chitin trong mai mực ống
Mầu mi(khối lượng mai mực ống) 1T12 (khôi lượng chitin) Ô=(ni2/mi)xl00% MI 1 kg 378 ~ 37,5% M2 1 kg 372 M3 1 kg 375
Phổ hồng ngoại của chitin được thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1: Phố hồng ngoại của /3-chỉtin
Từ hình 3.1 có thể quy kết các pic phổ đặc trung như sau: Vùng 3100 -í- 3600cm'' đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm hydroxyl (-OH), 287 lcm' 1
đặc trung cho dao động hoá trị của liên kết CH (vc_H); 1655 cm' 1 đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm cacbonyl c=0 (của amit I); 1560 cm' 1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết N-H (ô n_h) (amit II); 1393 em' 1 là đặc trưng cho dao động biến dạng của CH3 (symetrical angular defomation), 1071cm’' đặc trung cho dao động hóa trị của C-O-C trong liên kết P( 1 —>4) glucozit. DA của chitin tính được theo công thức {2.3} là 78%.
3.1.2. Điều chế chitosan từ chitin theo phương pháp kiềm đặc kết hợp nhiệtđộ cao độ cao
Phản ứng đeaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm thực chất là phản ứng thủy phân nhóm axetamit. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 120°c, nồng độ NaOH 50%, thời gian 12 giờ.
S ơ đồ 1.11: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin
Hiệu suất phản úng đeaxetyl hóa tính theo công thức {2.2} phần thực nghiệm: G|%= 26g/37,5g~70%. Như vậy, hiệu suất phản ứng đeaxetyl hóa là khá cao.
Chitosan thu được từ phản úng đeaxetyl hóa chitin có dạng màu trắng, xốp, tan tốt trong m ôi trường axit loãng n h ư axit axetic 1%.
3.1.2.1. Phổ hồng ngoại
Có thể nhận thấy rằng, phổ đồ của chitosan thu được không thay đổi nhiều so với (3-chitin (hình 3.2). Các tín hiệu đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết O-H và liên kết C-H hầu như không đổi. Sự giảm cường độ pic
1654,4 cm' 1 đặc trung cho dao động hóa trị của liên kết c=0 của nhóm amit và sự xuất hiện pic tại 1632 cm' 1 đặc trung cho dao động biến dạng của liên
kết N-H (của nhóm NH2).
Wavenumbers (cm -1) Dale Sal May 02 10 00 11 2015 M2 KBr
Scans 32 Resolution 4 000
Hình 3.2:Phô hong ngoại của P-chitosan
Dựa trên phổ IR, từ công thức {2.3} phần thực nghiệm tính được:
A 0 0 7 4
DA% = 115= - 1——xl 15~ 30% ^3450 0,2 84
3.1.2.2. P hắx-R ay
Phổ X-ray của chitosan điều chế từ mai mực ống (hình 3.3) cho thấy đỉnh nhiễu xạ ở vị trí góc 20 w 8,8 và 20 A°. Ket quả này phù họp với các công bố về đặc tính kết tinh của Ị3-chitosan.
Hình 3.3: Giản đồ nhiều xạ tia X của chitosan 3.1.2.3. Khối lượng phân tử
Ket quả đo áp suất thẩm thấu của dung dịch tại các nồng độ khác nhau được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 : Ket quả đo ảp suất thắm thấu của chitosan tại các nằng độ
khác nhau
Tên mẫu c (g/1 0 0 ml) dn (kêt quả trung
bình 3 lần đo) n (cm) n / c Mâu 1 0,025 30 0,314 12,58 Mâu 2 0,05 98 1,027 20,547 Mâu 3 0,1 341,6 3,582 35,817 Mâu 4 0,2 1225 12,842 64,209 Mâu 5 0,4 47,05 49,327 123,317
Vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ của c và n / c (hình 3.4) để tìm giá trị ngoại suy của n / c khi C—»0. Thay các giá trị vào công thức {2.5}, khối lượng phân tử trung bình của chitosan điều chế được là: 45594 g/mol tương đương với 453 KDa, khối lượng phân tử của chitin/chitosan nằm trong khoảng 50-Ỉ-2000 KDa.
3,1.3.Điều chế chitosan có DA thấp
Hình 3.5: Phó FT-IR của P-chỉtosan theo phương pháp phá kết tinh
Từ phổ hồng ngoại (hình 3.2) của chitosan thu được từ phản ứng deaxetyl hóa một lần chitosan thu được ở mục 3.1.2 trong dung dịch NaOH 50% và theo phương pháp phá kết tinh (hình 3.5) cho thấy cường độ pic hấp thụ đặc trung cho dao động hoá trị liên kết c = 0 của nhóm axetamit giảm mạnh, đồng thời xuất hiện píc hấp thụ tại 1603 cm' 1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết N-H.
Theo công thức {2.3} phần thực nghiệm, P-chitosan nhận được có DA« 0 % (hay DDA«100%), phản ứng deaxetyl hoá gần như diễn ra hoàn toàn.
3.1.3.2. Khối lượng phân tử
Ket quả đo áp suất thẩm thấu (ĨI) của chitosan điều chế theo phương pháp phá kết tinh được trình bày ở bảng 3.3. Khối lượng phân tủ’ chitosan tính được: Mn ~41326 g/mol tương đương với 410 KDa. Như vậy, phản ứng cắt mạch giảm khối lượng phân tử diễn ra song song với phản ứng deaxetyl hóa chitosan.
Bảng 3.3: Kết quả đo áp suất thấm thấu của chitosan DA^O
Tên mẫu C(g/100ml) dn (trung bình 3 lân đo) n (cm) n / c
MI 0,025 25,76 0,27 10,8
M2 0,05 89,22 0,935 18,70
M3 0,1 318,6 3,050 30,5
M4 0,2 291,1 11,46 57,3
H ình 3.6: Đồ thị biếu diễn mối quan hệ giữa n/c và c
Nhân xét 1:
+ Đã tách được chitin từ mai mực ống, hàm lượng chitin khoảng 37,5% + Đã điều chế được chitosan từ chitin thông qua phản ứng đeaxetyl hóa. Độ đeaxetyl hoá đạt được khi đeaxetyl hóa một lần trong dung dịch NaOH 50%, nhiệt độ 120°c là ~30%, khối lượng phân tử 453 KDa. Sử dụng phương pháp phá kết tinh thu được chitosan có độ axetyl hóa «0%, khối lượng phân tử 410 KDa.
3.2. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến phản ứng điều chế chỉtosan khối lượng phân tử thấp
3.2. 1. Anh hưởng của nồng độ axít HCl đến khối lượng phân tử trung bình (M n) sản phấm phản ứng đề polyme hoá chitosan
Đe nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ axit tới khả năng phản ứng đề polyme hóa chitosan (sử dụng hai loại chitosan có độ đề axetyl hóa ~ 30% và độ đề axetyl h ó a ~ 0 % th u đ ư ợ c ở trên), tiến h àn h th ự c hiện p h ản ứ n g cắt mạch sử dụng các dung dịch axit có nồng độ khác nhau: 0,1; 0,5; 1,0 ; 1,5 và
2,0 N ở 80°c, thời gian 12 giờ. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ axit thông qua khối lượng phân tủ’ trung bình số (xác định theo phương pháp đo áp suất thẩm thấu, sử dụng thiết bị OSMOMAT 090). Ket quả được trình bày ở bảng 3.4 sau:
Bảng 3.4: Kết quả xác định khối lượng phân tử khỉ sử dụng nồng độ axit khác nhau
Chitosan (DA~30%) Chitosan (DA~0%)
CM HC1 (N) Mn (Da) CM HC1 (N) Mn (Da) 0,1 45213 0,1 40563 0,5 17541 0,5 16859 1,0 8237 1,0 7542 1,5 7963 1,5 7489 2,0 7859 2,0 7425
Ket quả thu được ở trên cho thấy, khi tăng nồng độ axit thì khả năng phản ứng đề polyme hóa đối với cả hai loại chitosan đều tăng lên (thể hiện ở sự giảm mạnh khối lượng phân tử của chitosan). Ket quả trên cũng cho thấy nếu nồng độ axít HC1 cao thì sản phẩm phản ứng đề polyme hoá có khối lượng phân tử trung bình nhỏ, khả năng tan trong nước dễ hơn chitosan. Nhung phản úng có nhược điểm khó khăn trong việc thu hồi sản phẩm, lượng hoá chất dư thừa lớn gây ô nhiễm môi trường, chi phí hoá chất cao. Neu nồng độ axít HC1 thấp thì sản phẩm thu được có (Mn ) lớn, khả năng tan trong nước kém, khó úng dụng trong nông nghiệp. Vậy nồng độ HC1 thích họp nhất là IN, sản phẩm thu được có n>20 (M n <10.000 Da) ở điều kiện phản úng này có thể khắc phục những hạn chế trên.
sản phẩm phản ủng đề polyme hoá chitosan
Nhiệt độ phản ứng là yếu tố rất quan trọng đặc biệt khi phản ứng thực hiện trên quy mô lớn. Đe nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, tiến hành khảo sát phản ứng cắt mạch ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 30 -r 100°c, sử dụng axit có nồng độ IN, thời gian phản ứng 12 giờ. Ánh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng đề polyme hóa chitosan được đánh giá thông qua khối lượng phân từ của sản phấm chitosan thu được. Ket quả được trình bày ở b ản g 3.5 sau:
Bảng 3.5 : Kết quả xác định khối lượng phân tử khi phản ứng thực hiện ở 3.2,2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khối lượng phân tử trung bình ( Mn)
nhiệt độ khác nhau
Chitosan (DA~30%) Chitosan (DA~0%)
Nhiệt độ (°C) Mn (Da) Nhiệt độ (°C) Mn (Da)
30 38421 30 36526 40 33126 40 31265 50 24125 50 23541 60 16128 60 15643 70 13264 70 13106 80 8237 80 7542 90 7456 90 7312 100 7122 100 7015
Kết quả thu được ở trên cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng đề polyme hóa chitosan. Khi nhiệt độ tăng thì khả năng đề polyme hóa cũng tăng. Nhiệt độ thích họp cho phản ứng đề polyme hóa chitosan trong môi trường HC1 IN là 80°c.
3.2.3. Đánh giá độ tan trong nước của các mẫu chitosan trọng lượng phân tử thấp
Bảng 3 .6: Mối quan hệ giữa độ tan và khối ỉượng phân tử trung bình của các mẫu L wc
Mầu p2 p4 p6 p8
T(%) 2,3 5,2 25,2 26,5
Mn 33126 16128 8237 7122
Qua đó có thể kết luận: Chitosan có Mn càng nhỏ thì càng dễ tan trong nước. Nguyên nhân là do cấu trúc tinh thể giảm, phân tử ít cồng kềnh, vì vậy yếu tố không gian ít ảnh hưởng tới việc hình thành liên kết hydro giữa phân tử nước và phân tử LWC.
Nhân xét 2:
+ Khi tăng nồng độ axit thì khả năng phản ứng đề polyme hóa chitosan khối lượng phân tử thấp tăng lên. Nồng độ thích hợp là HC1 IN, sản phẩm có n>20(Ã ^< 10.000 Da).
+ Khi nhiệt độ tăng thì khả năng đề polyme hóa cũng tăng. Nhiệt độ thích hợp cho phản úng đề polyme hóa chitosan trong môi trường HC1 IN là 80°c.
+ Chitosan có Mtt càng nhỏ thì càng dễ tan trong nước.
3.3. Xác định cấu trúc cũa chỉtosan khối lượng phân tử thấp
*Pho hồng ngoại
Chitosan khối lượng phân tử thấp được điều chế thông qua phản ứng cắt mạch (đề polyme hóa) bằng tác nhân HC1 nồng độ IN, phản ứng thực hiện ở 80°c, thời gian 12 giờ, chitosan DA~30%. Phổ hồng ngoại của chitosan khối lượng phân tử thấp được trình bày ở hình 3.7
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumbers (cm-1)
Dale Sun May 03 05 05 29 2015 M3 KBr Scans 32
Resolution 4 000
Hình 3.7: Pho FT-IR của chỉtosan khối lượng phần tử thấp
Các pic đặc trang được quy kết như sau: 3390cm'1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm hydroxyl (-OH); 2959cm"1 đặc trưng cho dao động hóa