Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30- 100 mẫu và lặp lại 3 lần. Mẫu nuôi cấy được theo dõi, đánh giá dựa trên các chỉ tiêu : mẫu sống tái sinh, sự tạo chồi, nhân chồi, tạo callus…
Các số liệu nghiên cứu được tính toán theo phương pháp thống kê toán học excel.
Việc xử lý số liệu được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình IRRISTAT.
PHẦN 4:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tạo nguồn vật liệu khởi đầu
Hình ảnh 4 : Ngồng hoa non giống Lan Hoàng Thảo
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng đối với ngồng Lan Hoàng Thảo
Mẫu nuôi cấy có phản ứng mạnh với chất khử trùng nên chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm chọn hoá chất và thời gian khử trùng mẫu thích hợp. Tỷ lệ mẫu sống, mẫu chết, mẫu nhiễm là những chỉ tiêu được đánh giá. Kết quả thí nghiệm được tính sau 3 lần thí nghiệm và được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng đối với ngồng Lan Hoàng Thảo
Công thức Hoá chất Nồng độ(%) Thời gian(phút) Số lượng mẫu
Sau 4 tuần khử trùng mẫu (tính theo tỷ lệ %) Tỷ lệ mẫu sống Tỷ lệ mẫu chết Tỷ lệ mẫu nhiễm K1 HgCl2 0,1 5 100 33,3 6,6 60,1 K2 10 73,3 12,2 14,5 K3 15 53 36,5 13,6 K4 H2O2 10 20 30 10 23 10 67 K5 60 13,3 26,7 K6 66,6 13 20,4
Đồ thị 1: Biểu diễn tác động của hoá chất đến tỷ lệ mẫu sống, mẫu chết và mẫu nhiễm.
Kết quả bảng 1 cho thấy: Khử trùng bằng H2O2 ở nồng độ: 10%, 20%, 30% trong thời gian 10 phút cho tỷ lệ mẫu chết giảm dần từ (13-10)%, trong
khi đó tỷ lệ mẫu nhiễm tăng từ (20,4- 67)% và cho tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt 66,6% ở CT K6.
Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian: 5phút, 10 phút, 15 phút thì cho tỷ lệ mẫu chết cao và tỷ lệ mẫu nhiễm giảm hơn, tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt 73,3% ở CT K2 trong thời gian là 10 phút.
Từ kết quả trên cho thấy hoá chất khử trùng thích hợp là HgCl2 0,1%, khử trùng trong thời gian là 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống đạt 73,3%.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo chồi từ mắt ngủ của giống Lan Hoàng Thảo
Mẫu sau khi được khử trùng được cấy vào môi trường tạo chồi.
BAP là một cytokinin có tác dụng kích thích sự phân bào và tái sinh chồi mạnh từ mô nuôi cấy [20]. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo chồi từ mắt ngủ của Lan Hoàng Thảo được thể hiện ở bảng 2
Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo chồi từ mắt ngủ của giống Lan Hoàng Thảo
Công thức Nồng độ mg/l Số lượng mẫu
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi (%) B1 0 100 49 48 49 48 B2 0,5 100 61 61 59,3 59 B3 1,0 100 91 88 88 89 B4 1,5 100 85 84 84 86 B5 2,0 100 79 78 78 78 B6 2,5 100 82 82 80 81
Đồ thị 2:Biểu diễn sự tác động của BAP đến khả năng phát sinh chồi từ mắt ngủ của giống Lan Hoàng Thảo
Kết quả bảng 2 cho thấy: Ở CT B1 không có bổ sung BAP thì cho số mẫu phát sinh chồi thấp hơn so với CT từ B2- B6
Khi nồng độ BAP tăng từ 0,5- 1,0 mg/l thì số mẫu phát sinh chồi tăng đạt 88% sau 2 tuần nuôi cấy và đạt 89% sau 4 tuần nuôi cấy. Tiếp tục tăng nồng độ BAP lên từ 1,5- 2,5 mg/l thì số mẫu phát sinh chồi không tăng lên mà lại giảm đi từ 88% xuống 81%.
Từ kết quả trên cho thấy ở nồng độ BAP bằng 1,0 mg/l cho khả năng tạo chồi từ mắt ngủ cao nhất cho số mẫu phát sinh chồi sau 2 tuần nuôi cấy đạt 88% và số chồi hình thành là 90 chồi, sau 4 tuần nuôi cấy số mẫu phát sinh chồi đạt 89 và số chồi hình thành là 90chồi.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và nồng độ BAP = 1,0 mg/l đến khả năng tạo chồi của Lan Hoàng Thảo
NAA là chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm Auxin có tác dụng phân chia và kéo dài tế bào. BAP thuộc nhóm Cytokinin có tác dụng kích thích phát sinh chồi nách. Để tìm hiểu sự tác động của 2 chất này lên khả năng phát sinh hình thái của chồi Lan, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đến khả năng tạo chồi của Lan Hoàng Thảo. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3:
Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và nồng độ BAP = 1mg/l đến khả năng tạo PLB của Lan Hoàng Thảo
Công thức Nồng độ Số lượng
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ Plb tạo thành (%) Tỷ lệ mẫu sống Tỉ lệ Plb tạo thành (%) N1 0 100 59 50 56 54 N2 0,1 100 65 67 67 70 N3 0,5 100 82 70 82 82 N4 1,0 100 87 78 86 87 N5 1,5 100 85 74 82 77 N6 2,0 100 83 74 83 77
Đồ thị 3: Biểu diễn sự tác động của NAA và BAP= 1 mg/l đền khả năng tạo BLP của giống Lan Dendrobium
Kết quả bảng 3 cho thấy: Khi tăng nồng độ NAA từ (0- 1,0) mg/l thì số chồi tạo thành giảm từ 84 chồi lên 80 chồi sau 2 tuần nuôi cấy và tăng từ 84 chồi lên 85 chồi sau 4 tuần nuôi cấy. Nồng độ này cho chất lượng chồi đồng đều nhất và có màu xanh thẫm.
Tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 1,5 mg/l và 2,0 mg/l thì số chồi thu được không nhiều làm hệ số nhân bị giảm từ 3,72 lần xuống 3,63 lần sau 2 tuần nuôi cấy và từ 4,47 lần xuống 4,13 lần sau 4 tuần nuôi cấy. Hơn nữa, chất lượng chồi không đều và có nhiều chồi màu vàng nhạt.
Như vậy, nồng độ để tạo chồi tốt nhất là 1,0 mg/l kết hợp cùng 1mg/l BAP cho hệ số nhân tốt đạt 4,12 lần sau 2 tuần và 4,88 lần sau 4 tuần nuôi cấy với môi trương thích hợp là:
MS + 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy
Hình ảnh 5: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến quá trình tạo PLB của giống hoa Lan Hoàng Thảo
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan Hoàng Thảo
Hệ số nhân phụ thuộc vào khả năng phân bào của tế bào nuôi cấy trong điều kiện bình thường, tốc độ phân bào diễn ra chậm song khi có sự tác động của các phyto hooc môn thì quá trình phân chia tế bào diễn ra nhanh hơn. BAP bổ sung vào môi trường với nồng độ thích hợp sẽ kích thích số chồi phát sinh vì kích thích sự phân chia tế bào [20]. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh của giống Lan Hoàng Thảo được thể hiện ở bảng4:
Bảng 4: Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi của giống Lan Hoàng Thảo
Công thức Nồng độ (mg/l) Số lượng mẫu
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Số chồi thu được Hệ số nhân Số chồi thu được Hệ số nhân B1 0 100 93 0,93 112 1,12 B2 0,5 100 97 0,97 115 1,15 B3 1,0 100 112 1,12 119 1.19 B4 1,5 100 210 2.10 126 1,26 B5 2,0 100 123 1.23 124 1,24
Đồ thị 4: Biểu diễn sự tác động của BAP đến hệ số nhân chồi
Kết quả bảng 4 cho thấy: Khi bổ sung BAP vào môi trường nuôi cấy thì đều cho kết quả hệ số nhân cao hơn với môi trường không có BAP.
Khi nồng độ BAP tăng dần từ (0,5- 1,5) mg/l thì hệ số nhân tăng từ 0,97 lần lên 2,1 lần. Tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2,0 mg/l thì hệ số nhân lại giảm xuống còn 1,23 lần.
Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy, hệ số nhân cao đạt 2,1 lần ở nồng độ 1,5 mg/l BAP. Môi trường thích hợp cho quá trình nhân nhanh chồi của Lan Hoàng Thảo là:
MS + 1,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy
Hình ảnh 6: Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân chồi
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi Lan Hoàng Thảo
Sau khi nhân chồi được số lượng đủ lớn, giai đoạn kế tiếp là tạo cây hoàn chỉnh chuẩn bị đưa ra ngoài vườn ươm. Cây ra vườn ươm không chỉ đủ tiêu chuẩn về tạo lá, mà các tiêu chuẩn về rễ như: Số lượng rễ, chiều dài rễ, độ mập của rễ…đều là các yếu tố quyết định. Khi nuôi cấy trong điều kiện bình thường hoặc trên môi trường có bổ sung nồng độ BAP thấp cây Lan Hoàng Thảo vẫn ra rễ và thường chỉ có 1 hoặc 2 rễ. Nhưng khi đưa ra vườn ươm ngoài tự nhiên thường bị chết do bộ rễ mảnh, yếu, khó thích nghi với môi trường mới.
Môi trường tạo rễ thường là các môi trường có bổ sung các hợp chất của auxin. Để tìm hiểu vấn đề này chúng tôi tiến hành các thí nghiệm
nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi lan Hoàng Thảo
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng sau
Bảng 5: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi
Công thức Nồng độ NAA Số lượng
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Số chồi phát sinh rễ Số rễ thu được Tỷ lệ tạo rễ (%) Số chồi phát sinh rễ Số rễ thu được Tỷ lệ tạo rễ (%) D1 0 50 19 21 38 25 31 49 D2 0,1 50 35 45 71 43 51 86 D3 0,2 50 44 57 88 46 61 92 D4 0,3 50 43 50 87 45 75 91 D5 0,4 50 45 81 90 49 93 99 D6 0,5 50 49 91 98 49 97 100
Đồ thị 5: Biểu diễn sự tác động của NAA đến tỉ lệ ra rễ của giống Lan Hoàng Thảo
Qua bảng số liệu thu được cho thấy: Trên môi trường khổng bổ sung NAA tỷ lệ chồi ra rễ đạt thấp hơn so với các môi trường có bổ sung NAA chỉ có 38% sau 2 tuần và 49% sau 4 tuần nuôi cấy.
Ở môi trường có bổ sung NAA tỷ lệ chồi ra rễ tăng dần khi nồng độ NAA tăng từ (0,1- 0,5) mg/l. Tiếp tục tăng nồng độ NAA lên thì tỷ lệ chôi ra rễ tiếp tục tăng. Tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất đạt 98% sau 2 tuần nuôi cấy và 100% sau 4 tuần nuôi cấy ở D6 với nồng độ NAA là 0,5mg/l.
Nhự vậy môi trường thích hợp cho việc tạo rễ trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm là:
Vacin + 0,5mg/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Hình ảnh 7: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình rễ của chồi
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Từ các kết quả trên chúng tôi rút ra kết luận sau:
- Nồng độ và thời gian khử trùng tốt nhất cho ngồng hoa non giống Lan Hoàng Thảo là HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút, cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt 70%.
- Nồng độ BAP bằng 1,0 mg/l cho khả năng tạo chồi từ mắt ngủ cao nhất đạt 88% sau 2 tuần nuôi cấy và 89% sau 4 tuần nuôi cấy. Môi trường thích hợp cho khả năng tạo chồi từ mắt ngủ là:
MS+ 1,0 mg/l + 30g/l đường+ 6g/l Agar
- Khả năng để tạo PLB tốt nhất là ở nồng độ 1,0 mg/l NAA kết hợp với 1 mg/l BAP cho hệ số nhân sau 2 tuần là 4,12 lần và sau 4 tuần là 4,88 lần với môi trường ưu việt là:
MS + 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar - Nồng độ BAP bổ sung vào môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi của Lan Hoàng Thảo là 1,5 mg/l. Môi trường thích hợp để nhân nhanh là:
MS + 1,5mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
- Môi trường thích hợp cho việc ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm là:
Vacin + 0,5 g/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
5.2. Đề nghị
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tôi chưa hoàn thiện được qui trình tạo cây hoàn chỉnh đưa cây ra vườn ươm.
Trong thời gian tới đây, chúng tôi sẽ tiếp tục hoàn thiện qui trình nhân nhanh giống Lan mới có chất lượng hoa tốt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), “ Công nghệ sinh
học thực vật trong cải tiến của cây trồng”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, trang
62-80.
2. Phan Thúc Huân (1989), “Hoa lan cây cảnh và vấn đề phát triển sản
xuất kinh doanh”, NXB TP Hồ Chí Minh.
3. Phan Thúc Huân (2005), “Hoa lan nuôi trồng và kinh doanh”, NXB Phương Đông.
4. Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm, “Kỹ thuật nuôi trồng cây lan”, NXB Mỹ thuật.
5. Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Mạnh Chinh (2008), “Trồng, chăm sóc
và phòng trừ sâu bệnh cây hoa lan”, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
6. Dương Đức Huyến (1992), “Nghiên cứu phân loại chi Hoàng thảo -
Dendrobium Sw (họ lan- Orchidaceae) ở Việt Nam”, Luận án phó tiến sĩ khoa
học sinh học, NXB Hà Nội.
7. Phạm Thị Liên (2001), “ Nghiên cứu đánh giá và phát triển một số
giống địa lan ở miền Bắc Việt Nam”, luận án tiến sĩ nông nghiệp.
8. Nguyễn Xuân Linh (1998) , “Hoa và kỹ thuật trồng hoa”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
9. Trần Văn Mão(biên dịch) (2005), “Hỏi đáp về kỹ thuật nuôi trồng
hoa và cây cảnh(tập 1)”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
10. Chu Văn Mẫn (2001), “Ứng dụng tin học trong sinh học”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, trang 118-126.
11. Nguyễn Công Nghiệp (1986), “Trồng hoa lan”, NXB TP Hồ Chí Minh.
12. Nhiều tác giả (2008), “Hoa lan toàn tập”, NXB Phương Đông.
13. Mai Thị Tâm, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Trường Sơn (1999), “Nghiên cứu và nhân nhanh protocorm lan Dendrobium E.R. Kết
quả nghiên cứu khoa học nữ cán bộ giảng dạy Đại học nông nghiệp I”, 1997-
1999.
14. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1983), “ Chất điều hòa
sinh trưởng với cây trồng”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
15. Nguyễn Văn Uyển và cộng sự (1993), “Nuôi cấy mô thực vật phục
vụ cho công tác nhân giống cây trồng”, NXB Nông nghiệp.
16. Nguyễn Văn Uyển, Đỗ Năng Vịnh và cộng sự (1999), “Công nghệ
nhân giống các cây trồng quan trọng”, Báo cáo hội nghị Khoa học toàn quốc
về công nghệ sinh học, trang 96.
17. Đào Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga (2008), “Giáo trình hoa lan”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
18. Vũ Văn Vụ (1999), “Sinh lý thực vật”, NXB Giáo dục Hà Nội. 19. Phạm Hoàng Hộ,( 2000), ”cây cỏ Việt Nam ”, NXB Trẻ
20. Đỗ Năng Vịnh, (2003), ”Công nghệ sinh học cây trồng”, NXB Nông Nghiệp
Tài liệu tiếng Anh
19. Carlson R.F. (1964), “Dwarf fruit trees”, Mich. Arg. Ext. Serv. Bull, pp.432.
20. Murashige, T., and R. Skoog. (1962), “ A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue culture” , Phys. Plant. 15: 473-497.
21. Narayanaswamy, T., (1980), “ Regenneration of plants from tissue
culture. In: applied and Fundamental Aspects of plants cell, tissue and Organ culture. Eds. J. Reinert and Y.P.S Bajaj. Springer- Verlag, Berlin Heidelberg New York”, pp. 179-245.
22. Nickell, L.G.(1973), “ Tess - tube Approaches to by pass Sexx”, Hawaiian Planter’s Record.58, pp. 239 - 314.
23. Staritsky, G (1970), “Tissue culture of the oil palm ( elaeis
guineensis Jacq as a tool for its vegetative propagation)”, Euphytica, pp.228-
Tài liệu Internet 24. http://www.hoalanvietnam.org 25. http://www.hoinongdan.org.vn 26. http://www.longdinh.com 27. http://www.hcmbiotech.com.vn 28. http://dost.dadang.gov.vn . 29. http://www.tuvannongnghiep.com.vn
PHỤ LỤC
Các thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog,1962)
Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l)
NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4 370 KH2PO4 170 Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l)