Bên cạnh việc lai đầu dò SPA với đoạn bổ sung ADN đích, trên bề mặt thẻ PDMS carboxyl đã thực hiện các thí nghiệm đối chứng như sau: 1) Lai đầu dò SPA với đoạn ADN đối chứng có trình tự không bổ sung với đầu dò (5’-ATT GGA AAC GAT AGC TAA TAC CGC-3’); 2) Lai ADN đích trên bề mặt đế thẻ PDMS carboxyl không có đầu dò SPA hình 3.16.
Hình 3.16. Sơ đồ lai ADN đối chứng với đầu dò SPA và ADN đích với bề mặt đế thẻ PDMS carboxyl không có đầu dò SPA
Hình 3.17 thể hiện tương quan giữa các kết quả lai trên thẻ của ADN đích và các đối chứng với các nồng độ khác nhau (4.5 pmol, 9 pmol, 18 pmol). Ta thấy với ADN đích, khi lượng ADN đem lai tăng thì lượng ADN lai được cũng tăng theo trong cả trường hợp trên thẻ SPA và trên đế không có đầu dò SPA. Tuy nhiên, lượng ADN đích lai được trung bình cao khoảng gấp 2.4 lần trong trường hợp thứ nhất so với trường hợp 2. Tuy không có đầu dò SPA trên thẻ, ADN đích vẫn bám được vào đế thẻ
có thể là do sự hấp phụ ADN lên bề mặt thẻ. Với ADN đối chứng, lượng ADN lai được dao động dưới 2 pmol không phụ thuộc vào lượng ADN đối chứng đem lai.
Tại nồng độ ADN đem lai là 4.5 pmol, không thấy có sự khác biệt rõ ràng ở lượng ADN lai được của ADN đích và ADN đối chứng, nhưng từ nồng độ 9 pmol đã thấy rõ sự khác biệt ở lượng ADN lai được của ADN đích với ADN đối chứng ADN đích lai được gấp 8.7 lần ADN đối chứng lai được.
Hình 3.17. Các lượng ADN lai được tương đương với các lượng ADN đem lai của ADN đích, ADN đối chứng và ADN đích trên đế không có đầu dò SPA 3.3. Đánh dấu ADN bằng hạt từ và đánh giá kết quả bằng cảm biến AMR
3.3.1. Đánh dấu ADN bằng hạt từ
Thẻ SPA sau khi lai với ADN đích được đánh dấu hạt từ sau đó đưa lên cảm biến phát hiện từ để đo tín hiệu (sơ đồ hình 3.18). Hạt từ được dùng để đánh dấu từ lên sợi ADN đích là hạt siêu thuận từ thương mại (Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1) có kích thước 1 µm được bọc polyme và gắn đơn lớp protein streptavidin trên bề mặt (ferrite chiếm 26% khối lượng hạt) (hình 3.19.a). Do đoạn ADN đích có gắn biotin ở đầu 5’ nên sẽ liên kết với hạt từ-streptavidin nhờ liên kết đặc hiệu giữa streptavidin với biotin (hình 3.19.b). 2,1 2,6 4,4 1,8 0,3 1,7 0,39 0,72 1,22 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 4,5 9 18 Lư ợng AD N la i được (pm ol)
Lượng ADN đem lai (pmol)
ADN đích ADN đối chứng ADN đích trên đế không có đầu dò SPA
Hình 3.18. Sơ đồ biểu diễn quá trình đánh dấu ADN bằng hạt từ
(a) (b)
Hình 3.19. a. Ảnh FESEM của hạt từ. b. Cấu trúc của streptavidin và biotin Bên cạnh đó, đã thực hiện đánh dấu từ với các đối chứng như sau: đối chứng a: thẻ SPA không có ADN đích, đối chứng b: thẻ SPA với ADN đối chứng (có trình tự không bổ sung với đầu dò và không có biotin ở đầu 5’ (xem bảng 3.5), đối chứng c: thẻ không có đầu dò SPA với ADN đích (hình 3.20).
Hình 3.20. Sơ đồ mô tả thí nghiệm lai ADN và đánh dấu từ trên thẻ SPA với mẫu ADN đích và ba mẫu đối chứng
Sau khi ủ thẻ với hạt từ và rửa thẻ bằng đệm để loại bỏ các hạt từ không liên kết, thẻ được quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại vật kính 50x (độ phóng đại của kính hiển vi bằng độ phóng đại thị kính nhân với độ phóng đại vật kính) (hình 3.21). Có thể thấy được sự khác biệt tương đối giữa mẫu ADN đích và các mẫu đối chứng. Nếu như hình ảnh hạt từ của mẫu ADN đích thể hiện số lượng nhiều và dày đặc, thì hình ảnh chụp hạt từ của các mẫu đối chứng a, b, c thể hiện số lượng ít hơn hẳn.
Mẫu ADN đích 18 pmol Đối chứng a
Đối chứng b Đối chứng c
Hình 3.21. Hình ảnh quan sát bề mặt thẻ SPA bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại của vật kính 50x
3.3.2. Đánh giá kết quả đánh dấu ADN bằng hạt từ bằng cảm biến AMR
Đoạn ADN đích sau khi được đánh dấu từ trên thẻ SPA, được phát hiện bằng thiết bị cảm biến phát hiện hạt từ. Cảm biến sử dụng để phát hiện hạt từ là cảm biến từ điện trở dị hướng (anisotropic magnetoresistance) do nhóm tác giả Lê Khắc Quynh chế tạo tại phòng thí nghiệm trọng điểm micro-nano (Đại học Quốc gia Hà Nội) [14]. Hình 3.22 là sơ đồ mô tả cấu tạo hệ đo sử dụng cảm biến và thẻ dùng một lần SPA với ADN
đã được đánh dấu từ. Thẻ dùng một lần với sợi ADN đích được đánh dấu từ được đưa trực tiếp lên bề mặt của thanh cảm biến để tiến hành đo tín hiệu.
Hình 3.22. Sơ đồ cấu tạo và cách sử dụng của cảm biến AMR
Kết quả đo tín hiệu bằng cảm biến từ cho thấy chỉ trong trường hợp thẻ SPA ủ với ADN đích và sau đó được đánh dấu từ mới cho tín hiệu ra lớn hơn nhiễu (hình 3.23.a). Tín hiệu này tăng gần như tuyến tính với lượng ADN đích (hình 3.23.b). Giới hạn phạt hiện của cảm biến khoảng 4.5 pmol sợi đơn ADN đích. Các đối chứng a,b,c mô tả trong mục 3.3.1 chỉ cho tín hiệu tương đương với nhiễu nền (hình 3.23.a).
a) b)
Hình 3.23. a. Tín hiệu ra của cảm biến đối với thẻ SPA với các lượng ADN đích khác nhau và các đối chứng. b. Đồ thị phụ thuộc tín hiện ra của cảm biến vào lượng ADN
đích trên thẻ SPA
Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện của cảm biến AMR là nồng độ 4.5 pmol ADN đích, tại đó nồng độ dung dịch ADN đích đầu vào là 0.3 µM. So với phương pháp cảm biến sợi quang phát hiện ADN với độ nhạy ở nồng độ 0.5 µM [33] thì phương pháp dùng cảm biến AMR có tính khả quan và độ nhạy tốt hơn về cả giá thành
và phương pháp thực hiện. Bên cạnh đó có một vài phương pháp hiện đại tuy có giá thành cao nhưng có giới hạn phát hiện rất thấp như phương pháp đánh dấu huỳnh quang trên bản ADN chip có giới hạn phát hiện là 1nM [11] và phương pháp graphene hiệu ứng trường bằng cách đưa ADN vào môi trường hơi nước có chứa chất hóa học nhằm phát hiện ADN qua tín hiệu điện thông qua màng graphene có giới hạn phát hiện rất thấp là 1 pM [6].
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Đã thiết kế được ADN đầu dò SPA (độ dài 43 Nucleotide), với trình tự 5’- Amin-(T)20 CAGTATTTACCGCATGGTAGATA-3’, đặc hiệu cho gen 16S rARN của liên cầu khuẩn S.suis.
2. Đã chế tạo được thẻ dùng một lần bằng cách phủ polyme PDMS lên đế silic, sau đó chức năng hóa đế để cố định đầu dò SPA bằng phương pháp hóa học (dùng chất nối EDC). Mật độ đầu dò đạt được là 2.4 x 1013 sợi/cm2.
3. Khi lai đầu dò SPA ở trên thẻ dùng một lần với ADN đích cho thấy với ADN đích đem lai tăng thì lượng ADN lai được tăng. Tại lượng ADN đích đem lai là 9 pmol, có sự phân biệt giữa ADN đích và ADN đối chứng là 8.7 lần.
4. Sử dụng cảm biến từ đo lượng ADN đã được đánh dấu từ trên thẻ cho thấy tín hiệu cảm biến tăng tuyến tính với lượng ADN đích đem lai, giới hạn phát hiện là 4.5 pmol sợi đơn ADN đích.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
Lê Thị Hiên, Vũ Thị Huyền, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Thị Ngọc, Lương Hồng Nhung, Bùi Đình Tú (2015), Cố định protein albumin huyết thanh bò lên Polydimethylsiloxane chức năng hóa bằng APTES, SAA ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học, Kỷ yếu Hội nghị Vật lý chất rắn và Khoa học vật liệu toàn quốc lần thứ 9 – SPMS2015, 08-10/11/2015, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam, tr. 514.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Lê Thị Hiên, Vũ Thị Huyền, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Thị Ngọc, Lương Hồng Nhung, Bùi Đình Tú (2015), ”Cố định protein albumin huyết thanh bò lên Polydimethylsiloxane chức năng hóa bằng APTES, SAA ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học”, Kỷ yếu Hội nghị Vật lý chất rắn và Khoa học vật liệu
toàn quốc lần thứ 9 – SPMS2015, 08-10/11/2015, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam,
tr.514.
2. Lê Thị Hiên, Hà Thị Quyến (2014), Các phương pháp thực nghiệm nano sinh học, Trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Tiếng anh
3. Ashaari N.S, Ramarad S., Khairuddin D., Akhir N.A.M, Hara Y., Mahadi N.M., Mohamed R., Nathan S. (2015), “Development of repeatable arrays of proteins using immobilized DNA microplate (RAPID-M) technology”, BMC Res. Notes 8, pp 669-677.
4. Bhalla N., Jolly P., Formisano N., Estrela P. (2016), “Introduction to biosensors”, Essays in Biochemistry 60 (1), pp.1-8.
5. Cattaruzza F., Cricenti A., Flamini A., Girasole M., Longo G., Prosperi T., ADNreano G., Cellai L., Chirivino E. (2006), “Controlled loading of oligodeoxyribonucleotide monolayers onto unoxidized crystalline silicon; fluorescence-based determination of the surface coverage ADN of the hybridization efficiency; parallel imaging of the process by Atomic Force Microscopy”, Nucleic Acids Res. 34 (4), pp.1-13.
6. Chen T.Y., Loan P.T.K., Hsu C.L., Lee Y.H., Wang J.T.W., Wei K.H., Lin C.T., Li L.J. (2013), “Label-free detection of DNA hybridization using transistors based on CVD grown grapheme”, Biosens. Bioelectron. 41, pp.103- 109.
7. Chowdhury A.D., Gangopadhyay R., De A. (2014), “Highly sensitive electrochemical biosensor for glucose, DNA ADN protein using gold- polyaniline nanocomposites as a common matrix”, Sensor. Actuat. B: Chem.
190, pp.348-356.
8. Damborsky P., Svitel J., KatrlíK J. (2016), “Optical biosensors”, Essays in Biochemistry 60 (1), pp.91-100.
9. Ding L., Bond A.M., Zhai J., Zhang J. (2013), “Utilization of nanoparticle labels for signal amplification in ultrasensitive electrochemical affinity biosensors”, Anal. Chim. Acta 797, pp.1-12.
10.Efimenko K., Wallace W.E., Genzer J. (2002), “Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet ADN ultraviolet/ozone treatment”, J. Colloid Interface Sci. 254 (2), pp.306.
11.Fredonnet J., Foncy J., Cau J., Sesverac C., Francois J.M., Tresvisiol E. (2016), “Automated ADN Multiplexed Soft Lithography for the Production of Low- Density DNA Microarrays”, Microarrays 5 (4), pp.25.
12.Gottschalk M., Higgins R., Jacques M., Mittal K.R., Henrichsen J. (1989), “Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis”, J. Clin. Microbiol. 27 (12), pp.2633–2636.
13.Gupta P., Dillon A.C., Bracker A.S., George S.M. (1991), “FTIR studies of H2O ADN D2O decomposition on porous silicon surfaces”, Surf. Sci. Lett. 245 (3), pp.145.
14.Hien L. T., Quynh L. K., Huyen V. T., Tu B. D., Hien N. T., Phuong D. M., Nhung P. H., Giang D. T. H., Duc N. H. (2016), “DNA-magnetic bead detection using disposable cards ADN the anisotropic magnetoresistive sensor”,
Adv. Nat. Sci: Nanosci. Nanotechnol. 7 (4), pp. 045006.
15.Higgins R., Gottschalk M., Boudreau M., Lebrun A., Henrichsen J. (1995), “Description of six new capsular types (29-34) of Streptococcus suis”, J. Vet. Diagn. Invest. 7, pp.405-406.
16.Kanungo M., Mettu S., Law K.Y., Daniel S. (2014), “Effect of roughness geometry on wetting ADN dewetting of rough PDMS surface”, Langmuir 30 (25), pp.7358.
17.King S.J., Allen A.G, Maskell D.J., Dowson C.G., Whatmore A.M. (2004), “Distribution, Genetic Diversity, ADN Variable Expression of the Gene Encoding Hyaluronate Lyase within the Population Streptococcus suis”, J. Bacteriol. 186
(14), pp.4740.
18.Lamour G., Hamraoui A., Buvailo A., Xing Y., Keuleyan S., Prakash V., Eftekhari-Bafrooei A., Borguet E. (2010), “Contact Angle Measurements Using a Simplified Experimental Setup”, J. Chem. Educ. 87, pp.1403–1407.
19.Lipiec E., Kowalska J., Lekki J., Wiechec A., Kwiatek W.M. (2012), “FTIR Microspectroscopy in Studies of DNA Damage Induced by Proton Microbeam in Single PC-3 Cells”, Acta. Phys. Pol. A 121, pp.506-509.
20.Marois C., Bougeard S., Gottschalk M., Kobisch M. (2004), “Multiplex PCR Assay for Detection of Streptococcus suis Species ADN Serotypes 2 ADN 1/2 in Tonsils of Live ADN Dead Pigs”, J. Clin. Microbiol. 42 (7), pp.3169–3175. 21.Mazokopakis E.E., Kofteridis D.P., Papadakis J.A., Gikas A.H., Samonis G.J.
(2005), “Frist case report of Streptococcus suis septicaemia ADN meningitis
from Greece”, Eur. J. Neurol. 12 (6), pp.487–489.
22.Michel W., Mai T., Naiser T., Ott A. (2007), “Optical Study of DNA Surface Hybridization Reveals DNA Surface Density as a Key Parameter for Microarray Hybridization Kinetics”, Biophys. J. 92 (3), pp.999–1004.
23.Mongra A.C., Kaur A. (2012), “Overview of biosensors development around the world”, InteARNtional JouARNl of Biomedical ADN Advance Research 03 (07), pp. 519-530.
24.Nguyen H.H., Park J., Kang S., Kim M. (2015), “Surface Plasmon Resonance: A Versatile Technique for Biosensor Applications”, Sensors 15, pp.10481- 10510.
25.Nimse S.B., Song K., Sonawane M.D., Sayyed D.R., Kim T. (2014), “Immobilization Techniques for Microarray: Chanllenges ADN Applications”,
Sensors 14, pp.22208-22229.
26.Okura M., Osaki M., Nomoto R., Arai S., Osawa R., Sekizaki T., Takamatsu D. (2016), “Current Taxonomical Situation of Streptococcus suis”, Pathogens 5,
pp.45-59.
27.Özçam A.E., Efimenko K., Genzer J. (2014), “Effect of ultraviolet/ozone treatment on the surface ADN bulk properties of poly(dimethyl silaxane) ADN poly(vinylmethyl siloxane) networks”, Polymer 55 (14), pp.3107-3119.
28.Perch B., Kristjansen P., Skadhauge K. (1968), “Group R streptococci pathogenic for man. Two cases of meningitis ADN one fatal case of sepsis”,
Acta Pathol. Microbiol. ScADN. 74 (1), pp.69-76.
29.Radu G.L., Truică G.I., Penu R., Moroeanu V., Litescu S.C. (2012), “Use of the fourier transform infrared spectroscopy in characterization of specific samples”,
30.Samanta A., Medintz I.L. (2016), “Nanoparticles ADN DNA – a powerful ADN growing functional combination in bionanotechnology”, Nanoscale 8,
pp.9037-9095.
31.StackebrADNt E., Goebel B.M. (1994), “Taxonomic note: A place for DNA- DNA reassociation ADN 16S rARN sequence analysis in the present species definition in bacteriology”, Int. J. Syst. Bacteriol. 44, pp.846-849.
32.Stuart B.H. (2004), Infrared Spectroscopy: Fundamentals ADN Applications,
Wiley, New York, pp.152.
33.Sun D., Guo T., Ran Y., Huang Y., Guan B. (2014), “In-situ DNA hybridization detection with a reflective microfiber grating biosensor”, Biosens.
Bioelectron. 61, pp.541-546.
34.Turner A.P.F. (2013), “Biosensors: sense ADN sensibility”, Chem. Soc. Rev. 42 (8), pp.3184-3196.
35.Vigneshvar S., Sudhakumari C.C., Senthikumaran B., Prakash H. (2016), “Recent advances in biosensor technology for potential applications-An overview”, Front. Bioeng. Biotechnol. 4 (11).
36.Vincent H.A., Phillips J.O., Henderson C.A., Roberts A.J., Stone C.M., Mardle, C.E., Callaghan A.J. (2013), “An Improved Method for Surface Immobilisation of ARN: Application to Small Non-Coding ARN - mARN Pairing”, PLoS
ONE 8 (11), pp.79142.
37.Wang Z., Li R.X. (2007), “Fabrication of DNA micropatterns on the polycarbonate surface of compact discs”, Nanoscale Res. Lett. 2, pp.69–74. 38.Wertheim H.F.L., Nghia H.D.T., Taylor W., Schultsz C. (2009), “Streptococcus
suis: An Emerging Human Pathogen”, Clin. Infect. Dis. 48 (5), pp.617-625.
39.Wu H., Huang B., Zare R.N. (2005), “Construction of microfluidic chips using polydimethylsiloxane for adhesive bonding”, The Royal Society of Chemistry 5, pp.1393–1398.
40.Wu Y., Lai R.Y. (2013), “Development of a “signal – on” electrochemical DNA sensor with an oligo-thymine spacer for point mutation detection”, Chem.
Commun. 49 (33), pp.3422 – 3424.
41.Wu Y., Yang X., Yi X., Liu Y., Chen Y., Liu G., Li R.W. (2015), “Magnetic Nanoparticle for Biomedicine Applications”, J. Nanotechnol. Nanomed. Nanobiotechnol. 2 (1), pp.3-9.
42.Xia N., Deng D., Zhang L., Yuan B., Jing M., Du J., Liu L. (2013), “SADNwich-type electrochemical biosensor for glycoproteins detection based on dual-amplification of boronic acid-gold nanoparticles ADN dopamine-gold nanoparticles”, Biosens. Bioelectron. 43, pp.155-159.
43.Yin J., Han X., Cao Y., Lu C. (2014), “Surface Wrinkling on Polydimethylsiloxane Microspheres via Wet Surface Chemical Oxidation”, Sci.
PHỤ LỤC Phụ lục 1:
Bảng mã tên và thứ tự các chủng của loài S.suis và các loài của giống Streptococcus
cho gen 16S rARN
Phân loại STT Tên loài Mã
Các loài trong giống Streptococcus 1 Streptococcus thermophilus strain ATCC 19258 NR_042778.1 2 Streptococcus vestibularis strain ATCC 49124 NR_042777.1 3 Streptococcus salivarius CCHSS3 strain CCHSS3 NR_102816.1
4 Streptococcus equinus strain
NCDO 1037 NR_114642.1 5 Streptococcus constellatus subsp. pharyngis NR_121747.1 6 Streptococcus intermedius strain NCTC 11324 NR_118938.1 7 Streptococcus anginosus strain NCTC 10713 NR_118937.1
8 Streptococcus sobrinus strain
NCTC 12279
NR_114727.1
9 Streptococcus sobrinus strain
ATCC 33478
AY188349.1
10 Streptococcus downei strain
MFe 28
NR_042774.1
11 Streptococcus macacae strain
ATCC 35911
NR_042775.1
12 Streptococcus oralis strain
ATCC 35037
13 Streptococcus oralis AF003932.1
14 Streptococcus mitis strain
NCTC 12261
NR_115560.1
15 Streptococcus parasanguis AF003933.1
16 Streptococcus sanguis AF003928.1
17 Streptococcus cristatus strain
ATCC 51100
NR_042771.1
Các chủng của loài S.suis
18 Streptococcus suis strain L010 FJ434463.1
19 Streptococcus suis strain
CSCDC 119-176
JX207111.1
20 Streptococcus suis strain S735 NR_036918.1
21 Streptococcus suis strain
ATCC 43765
AB002525.1
22 Streptococcus suis isolate
YS121
KM972312.1
23 Streptococcus suis AF009502.1
24 Streptococcus suis AF009500.1
25 Streptococcus suis AF009504.1
26 Streptococcus suis AF009505.1