Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật

3.2.5.1 Phương pháp đồng nhất và pha loãng mẫu

Cân chính xác 1 gram mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng đã chuẩn bị trước, đồng nhất mẫu ta sẽ được dung dịch huyền phù có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu. Dung dich mẫu đồng nhất tiếp tục được pha loãng theo dãy thập phân.

Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai có chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý vô trùng, trộn đều bằng Vortex. Độ pha loãng của mẫu lúc này là 10-2. Cứ tiếp tục như vậy để có mẫu ở các độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5…

3.2.5.2 Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí

Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 4884 –2005).

Cách tiến hành: sau khi pha loãng mẫu, chọn 2 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ chan lên 2 đĩa NA, dùng que chan chan đều trên mặt thạch, lật ngược đĩa lại, ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ.

Cách tính kêt quả: đếm tất cả những khuẩn lạc mọc trên mặt thạch, chọn những đĩa có số khuẩn lạc từ 25 –300. Công thức tính: n n xdxV C A 2 10,1   Trong đó:

-A: Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 gram mẫu (CFU/g)

-C: số khuẩn lạc đếm được trong các đĩa ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp.

-n1: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được.

-n2: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ hai đếm được.

-d: nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được.

-V: lượng mẫu cấy.

Sơ đồ3.2 Quy trìnhđịnh lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

3.2.5.3 Phương pháp định lượngColiforms

Định lượng Coliformsbằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo tiêu chuẩn Việt Nam(TCVN 6848–2007). 24h 37oC 0,1ml Mẫu Dung dịch pha loãng Nutrient Agar Đếm khuẩn lạc

Cách tiến hành: sau khi pha loãng mẫu, chọn 2 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ chan lên 2 đĩa môi trường VRBL, dùng que chan chan đều lên mặt thạch, lật ngược đĩa lại, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Trên môi trường VBRL khuẩn lạc Coliforms có 2 dạng: điển hình và không điển hình, khuẩn lạc điển hình có màu đỏ ánh tía, đường kính 0,5mm hoặc lớn hơn, đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh. Chọn 5 khuẩn lạc không điển hình cấy lên môi trường BGBL trong ống nghiệm có Durham, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ, khẳng địnhColiformskhi có bọt khí xuất hiện sau khi ủ.

Sơ đồ 3.3 Quy trìnhđịnh lượngColiforms

Cách tính kết quả: chọn các đĩa petri có số khuẩn lạc từ 10 – 150, trên mỗi đĩa số khuẩn lạcColiformsđiển hìnhđược tính theo công thức:

N=Ađh + Akđh x R Trong đó:

-N: số khuẩn lạc trên đĩa

-Ađh: số khuẩn lạc điển hìnhđếm được

-Akđh : số khuẩn lạc không điển hìnhđếm được

-R: tỷ lệ dương tính của khuẩn lạc không điển hình

Coliformsdương tính Ống Durham có sinh khí Môi trường BGBL đục BGBL cóống Durham Khuẩn lạc không điển hình

Đếm khuẩn lạc

Khuẩn lạcColiformsđiển hình

24h VRBL 0,1ml Dung dịch pha loãng Mẫu 37oC 24h 37oC

Công thức tính tổng sốColiformstrong 1 gram mẫu: n n dV C A . . 1 , 0 2 1   Trong đó:

-A: Tổng sốColiformstrong 1 gram mẫu (CFU/g)

-C: số khuẩn lạc đếm được trong các đĩa ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp.

-n1: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được.

-n2: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ hai đếm được.

-d: nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được.

-V: lượng mẫu cấy.

3.2.5.4 Định lượngEscherichia coli

a. Định lượngE. colibằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Cách tiến hành: sau khi pha loãng mẫu, chọn 2 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ chan lên 2 đĩa MacConkey, dùng que chan chan đềulên mặt thạch, lật ngược đĩa lại, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Trên môi trường MacConkey vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc to, tròn, màu hồng tím sen hoặc hồng đậm đến đỏ, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thước 2 – 3mm.

Cách tính kêt quả:

Đếm tất cả những khuẩn lạc mọc trên mặt thạch, chọn những đĩa có số khuẩn lạc từ 25 –300. Công thức tính: n n dV C A . . 1 , 0 2 1    Trong đó:

-A: Tổng số vi khuẩnE. colitrong 1 gram mẫu (CFU/g)

-C: số khuẩn lạc đếm được trong các đĩa ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp.

-n1: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được.

-n2: số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ hai đếm được.

-d: nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được.

b. Kiểm tra đặc tính sinh hóa

Kiểm tra đặc tính sinh hóa những khuẩn lạc E. coli được chọn qua các phản ứng KIA, MR, VP, Indole và Citrate.

Môi trường Kligler Iron Agar (KIA):

Lấy vi khuẩn từ môi trường NA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng KIA, ủ ở 37oC trong 24 giờ E. colilên men đường glucose và lactose nên phần thạch đứng và thạch nghiêng có màu vàng, không sinh H2S và sinh hơi.

Phản ứng kiểm tra tính sử dụng Citrate:

Lấy vi khuẩn từ môi trường NA cấy vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng Simmon citrate,ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Nguyên tắc: trong môi trường Citrate có chứa Sodium citrate, vi khuẩn nào sử dụng được carbon từ muối Citrate này thì sẽ biến Sodium citrate này thành những chất làm kiềm hóa môi trường với sự hiện diện của chất chỉ thị

Kiểm tra đặc tính sinh hóa

24h 37oC

Chọn 2 khuẩn lạc cấy thuần trên NA 24h MacConkey Agar 0,1ml mẫu Đồng nhất và pha loãngđến nồng độ thích hợp 1g mẫu 37oC

KIA Citrate Indole MR VP

(+) (–) (+) (+) (–)

Glucose Lactose Sinh hơi H2S

(+) (+) (+) (–)

tryptophanase

màu Bromothymol blue, môi trường sẽ đổi màu từ màu xanh lá cây (pH = 6,9) sang màu xanh dương (pH = 7,6).

Phản ứng dương tính (+): môi trường từ màu xanh lá chuyển sang màu xanh dương.

Phản ứng âm tính (–): môi trường vẫn giữ nguyên màu xanh lá ban đầu.

Phản ứng kiểm tra tính sinh Indole:

Lấy vi khuẩn từ môi trường NA, cấy vào ống nghiệm chứa môi trường Peptone, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs để yên vài phút.

Nguyên tắc: một số vi khuẩn có khả năng sản xuất Indole từ Tryptophan do tiết được men tryptophanase.

Tryptophan Indole + Pyruvic acid + Ammonia

Khi có sự hiện diện của p –dimethylaminobenzaldehyde (có trong thuốc thử Kovac’s), Indole sẽ kết hợp với chất này để trở thành hợp chất Dimethylammonium có màu đỏ.

Phản ứng dương tính (+): trên bề mặt môi trường từ màu vàng xuất hiện mộtlớp màu đỏ.

Phản ứng âm tính (–): trên bề mặt môi trường xuất hiện lớp màu vàng.

Phản ứng Methylene Red (MR):

Nguyên tắc: Methyl Red được dùng làm chất chỉ thị pH của môi trường, một số vi khuẩn sinh acid từ glucose đủ để làm đỏ môi trường, một số khác không có đặc tính này. Methyl Red đỏ ở pH nhỏ hơn 4,2 và vàng khi pH lớn hơn 6,3.

Phản ứng dương tính (+): môi trường chuyển sang màu đỏ sau khi nhỏ thuốc thử

Phản ứng âm tính (–):môi trường có màu vàng

Phản ứng Voges – Proskauer (VP): nhỏ vài giọt thuốc thử Voges Proskauer, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử NaOH 40%, để yên vài phút.

Nguyên tắc: thử nghiệm VP để tìm Acetyl methyl carbinol (acetoin) được sinh ra từ glucose. Nếu có chất này trong canh khuẩn và với sự hiện diện của khí trời nó sẽ bị oxi hóa trong môi trường kiềm để biến đổi thành Diacetyl,

Diacetyl sẽ phản ứng với Creatine dưới sự xúc tác của  – napthol để tạo thành một phức hợp màu đỏ.

Phản ứng dương tính (+): trên bề mặt môi trường không màu sau khi nhỏ thuốc thử xuất hiện vòng đỏ.

Phản ứng âm tính (–): trên bề mặt môi trường vẫn giữ nguyên không màu.