3.3.1. Các phương pháp phân tích
Hiệu quả xử lý nước thải được đánh giá thông qua các chỉ số sau: pH, COD, BOD5, SS, TS, ΣN, ΣP,...Hiệu quả sinh khí biogas của thiết bị EGSB được đánh giá bằng lượng khí CH4 tạo ra cho 1g COD chuyển hóa.
3.3.1.1. Định lượng COD (Chemical Oxygen Demand)
Nhu cầu oxy hóa học (COD) là lượng oxy cần thiết để oxy hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ có trong nước thải bằng các chất oxy hóa mạnh.
COD được xác định bằng phương pháp hồi lưu đóng.
+ Nguyên tắc xác định: Dùng chất oxy hóa mạnh (K2Cr2O7) để oxy hóa các hợp chất có thể oxy hóa được trong nước thải cần phân tích. COD được xác định gián tiếp qua lượng K2Cr2O7 tiêu tốn.
+ Cơ chế phản ứng:
Chất hữu cơ + Cr2O72- Cr3+ + H2O (môi trường axit) Cr2O72- + 14H+ + 6e 2Cr23+ + 7H2O
Phản ứng được tiến hành trong vòng 2 giờ ở nhiệt độ 1500
C với xúc tác HgSO4 trong 2 giờ. Sử dụng Ag2SO4 để loại ảnh hưởng của Cl- có trong nước thải. Lượng K2Cr2O7 dư được chuẩn lại bằng muối Mo với chỉ thị Feroin.
3.3.1.2. Định lượng BOD5 (Bio-Chemical Oxygen Demand)
Nhu cầu oxy sinh học (BOD) là lượng oxy cần thiết để oxy hóa hết những thành phần có thể oxy hóa sinh học ở điều kiện tiêu chuẩn (pH = 6,5÷7,5, ở nhiệt độ 200C, áp suất 1at, không có ánh sáng)
+ Nguyên tắc xác định: Định lượng BOD bằng thiết bị Oxitop (có gắn sensor BOD) dựa trên sự giảm áp do CO2 sinh ra được hấp thụ bởi các hạt kiềm mạnh. Sự giảm áp được bộ vi xử lí trong sensor chuyển thành giá trị BOD tương ứng.
3.3.1.3. Định lượng hàm lượng chất rắn lơ lửng SS (Suspended Solids)
+ Nguyên tắc xác định: SS được xác định bằng phương pháp khối lượng, dựa vào sự tăng khối lượng của giấy lọc sấy khô ở 1050C đến trọng lượng không đổi sau khi đã lọc mẫu.
+ Cách tiến hành: Lấy thể tích V (ml) mẫu xác định, lọc lấy phần chất rắn lơ lửng bằng giấy lọc đã được sấy khô và cân đến khối lượng không đổi ở 1050C. Giấy lọc có kích thước lỗ mao quản 0,45µm. Sau đó sấy giấy lọc đã chứa mẫu đến trọng lượng không đổi ở 1050
C. SS = v b a x1000 (mg/l)
a: Khối lượng giấy sau khi lọc mẫu (mg) b: Khối lượng giấy trước khi lọc mẫu (mg) v: Dung tích mẫu (ml)
3.3.1.4. Định lượng Nitơ tổng
Nitơ tồn tại trong các hợp chất hữu cơ được gọi là nitơ hữu cơ. Nitow hữu cơ bao gồm nitơ trong hợp chất amino axit, amin, amit, imit, các dẫn xuất của nitơ và một số hợp chất khác.
Hầu hết các hợp chất hữu cơ chứa nitơ dẫn xuất của amoniac, vì vậy nitơ trong trường hợp này có số oxy hóa -3.
Phương pháp kjeldahl được sử dụng để xác định N ở trạng thái oxy hóa -3 bao gồm cả nitơ hữu cơ và nitơ amon.
a) Nguyên tắc xác định
Trong môi trường axit đặc (H2SO4) và sự có mặt của hỗn hợp xúc tác K2SO4 + CuSO4 + Se, nitơ hữu cơ và nitơ amoniac được chuyển hóa thành nitơ amoni (NH4+). Giải phóng amoniac từ amoni sunfat bằng cách thêm kiềm và chưng cất vào dung dịch boric. Xác định amoni trong phần cất bằng cách chuẩn độ với axit chuẩn hoặc bằng phương pháp trắc quang.
b) Cơ chế
- Amon hóa: Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4đậm đặc ở nhiệt độ cao
R-CHNH2-COOH + H2SO4 = NH3 + CO2 + SO2 + H2O 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4
- Giải phóng NH3 từ amoni sunfat bằng cách thêm kiềm và chưng cất trong dung
dịch boric
(NH4)2SO4 + NaOH = Na2SO4 + 2NH3 + H2O 2NH3 + 4H3BO3 + 2H2O = (NH4)2B4O7 + 7H2O
- Định lượng (NH4)2B4O7 (tetraborat amon) tạo thành bằng dung dịch H2SO4 hoặc
(HCl) chuẩn, tính được hàm lượng nitơ.
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O = (NH4)2SO4 + 4H3BO3
c) Tính kết quả: Nồng độ nitơ Kjeldahl được xác định theo công thức
C = 0 2 1 V V V .CHCl.14,01x1000 (mg/l) Trong đó: V0: Thể tích mẫu thử (ml)
V1: Thể tích HCl tiêu chuẩn dùng để chuẩn độ mẫu (ml) V2: Thể tích HCl tiêu chuẩn dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml)
CHCl: Nông độ chính xác của axit HCl tiêu chuẩn dùng để chuẩn độ (mol/l) 14,01: Khối lượng nguyên tử nitơ
Chú ý:
Trong quá trình vô cơ hóa, các chất khí độc SO2, H2S, HCN có thể sinh ra, vì vậy phải tiến hành vô cơ hóa trong tủ hút hoặc phải lắp đặt bộ phận xử lý phía sau
Bộ cất nitơ phải được đảm bảo kín không gây thất thoát NH3 trong quá trình chưng
Phần cặn còn lại sau khi chưng chứa Selen (rất độc) cần thu gom và chứa vào bình riêng để có biện pháp xử lý thích hợp.
3.3.1.5. Định lượng photpho tổng
Photpho trong nước thải tồn tại ở dạng orthophotphat (PO43-, HPO42-, H3PO4), polyphotphat (Na3(PO4)6) và photphat hữu cơ.
a) Nguyên tắc xác định
Toàn bộ photpho hữu cơ và vô cơ trong mẫu được chuyển về dạng orthophotphat. Phản ứng của octophotphat và molipdat và antimon trong môi trường axit sẽ tạo phức chất antimon photphomilipdat.
Khử phức chất bằng axit ascobic tạo thành phức chất molipden màu xanh đậm. Đo độ hấp thụ của dung dịch sẽ xác định được nồng độ octophotphat.
b) Cách tiến hành
- Lập đường chuẩn
- Từ mật độ quang của mẫu và mẫu trắng, dựa vào đường chuẩn tính được lượng P ứng với thể tích dung dịch đã hút.
- Hàm lượng P có trong mẫu phân tích có thể tính theo công thức:
C =
V m
(mg/l)
m: Hàm lượng P có trong bình tương ứng với thể tích đã hút (µg) C: Hàm lượng P (mg/l)
V: Thể tích mẫu lấy phân tích (ml)
3.3.1.6. Xác định hàm lượng CH4 thông qua CO2
Biogas thu được chứa chủ yếu là khí CH4 và CO2. Các tạp chất khác như N2, H2S, NH3, H2...chỉ chứa khoảng 1÷2%.
a) Nguyên tắc xác định CO2
Cacbon dioxyt tác dụng với Ba(OH)2 tạo thành kết tủa BaCO3 CO2 + Ba(OH)2 = BaCO3↓ + H2O
Chuẩn Ba(OH)2 dư bằng axit oxalic với chất chỉ thị phenolphtalein. Từ lượng Ba(OH)2 tiêu tốn tính được lượng khí CO2 có trong mẫu.
Mang dụng cụ đến nơi lấy mẫu (dùng túi chứa khí chuyên dụng), lấy mẫu vào
túi, đưa về phòng thí nghiệm để phân tích.
Bình phản ứng thể tích 500ml (sạch, khô)
Dùng pipet lấy 50ml (V) dung dịch Baryt cho vào chai. Đem chai hút chân không (loại hết không khí). Sau đó đưa mẫu cần phân tích vào chai. Thực hiện quá trình hấp thụ trong thời gian 4h.
Chú ý:
Trong thời gian hấp thụ mẫu cần được lắc thường xuyên (15 phút/lần) để đảm bảo CO2 được hấp thụ hoàn toàn.
Sau 4h lấy ra 10ml (a) cho vào bình nón, nhỏ giọt phenolphtalein và chuẩn lại bằng dung dịch axit oxalic đến mất màu hồng. Ghi lượng axit oxalic đã dùng.
Để chuẩn mẫu trắng lấy 10ml dung dịch Baryt. Thêm 4 giọt phenolphtalein và chuẩn lại với dung dịch axit oxalic, ghi thể tích dung dịch axit oxalic đã dùng chuẩn mẫu trắng. c) Tính kết quả CO2 = ) ( 1000 . . 1 , 0 ). ( 0 V V a V n N (% hoặc ml/l) V: Thể tích dung dịch Baryt cho vào chai (ml)
V0: Thể tích khí biogas đã lấy cho vào chai ở đktc (ml) a: Thể tích hấp thụ đem chuẩn độ (ml)
N: Thể tích dung dịch axit oxalic chuẩn độ mẫu trắng (ml) n: Thể tích dung dịch axit oxalic chuẩn độ mẫu phân tích (ml)
d) Tính hàm lượng CH4 thông qua CO2
%CH4 = 100% - %CO2 - 1%
3.3.2. Hiệu quả xử lý nước thải bằng hệ thống EGSB
Được đánh giá dựa trên các thông số sau:
a) Hiệu quả khử COD
ηCOD = v r v COD COD COD .100 (%) b) Tải trọng COD
qCOD = . ( ) 1 2 r hd r hd v COD V COD Q V COD Q
(kg/m3.ngày) hay (g/l.ngày)
c) Hiệu suất thu biogas
ηbiogas = ) ( . 1000 . 2 1 r r hd v biogas COD COD V COD Q V (%)
Q: Lưu lượng nước thải vào thiết bị EGSB (l/ngày) CODv: COD của nước thải vào thiết bị EGSB (g/l)
CODr1: COD của nước thải ra thiết bị EGSB ngày hôm trước (g/l) CODr2: COD của nước thải ra thiết bị EGSB ngày hôm sau (g/l) Vhđ: Dung tích làm việc của thiết bị EGSB (lít)
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Tuyển chon, phân lập dạng vi sinh trong công nghệ EGSB
4.1.1. Nghiên cứu tuyển chọn, phân lập dạng vi sinh vật sử dụng trong công nghệ EGSB nghệ EGSB
4.1.1.1. Nguyên liệu và hóa chất a) Nguyên liệu
Thu thập mẫu bùn từ hệ thống xử lý nước thải kỵ khí của nhà máy Bia Hà Nội để phân lập vi khuẩn kỵ khí sinh metan.
b) Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này có độ tinh khiết cao của các hãng trên thế giới như New England Biolabs, Sigma, Merk .v.v.
Cặp mồi 27F và 1492R được tổng hợp tại hãng InvitrogenTM
, vector PCR® 2.1 (Invitrogen).
Mồi xuôi (27F ): 5’ - AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3’ Mồi ngược (1492R) : 5’ - GGY TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’
Cặp mồi catechol 2,3-dioxygenase được tổng hợp tại hãng Alpha DNA
(Canada).
Mồi xuôi (C23OF): 5’ - ATG GAT DTD ATG GGD TTC AAG GT-3’ Mồi ngược (C23OR): 3’-ACD GTC ADG AAD CGD TCG TTG AG-5’ 4.1.1.2. Môi trường nuôi cấy
Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy sau:
- Môi trường làm giàu và phân lập vi khuẩn sinh metan (g/l); - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh metan (g/l);
- Môi trường muối khoáng dịch (g/l)
- Môi trường muối khoáng thạch (g/L): Thành phần các loại hóa chất giống như môi trường khoáng dịch nhưng được bổ sung thêm 20g Agar.
- Môi trường muối khoáng được bổ sung thêm hỗn hợp vitamin, hỗn hợp vi lượng và cao men. Môi trường trước khi được sử dụng được khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 25 phút.
Môi trường LB thạch (g/L): Thành phần các hóa chất tương tự môi trường LB dịch nhưng có bổ sung thêm 20g Agar.
- Nước muối sinh lý (0,85%)
NaCl 8,5g Nước cất 1 lít
4.1.1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh - Viện Công nghệ môi trường – thuộc Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, bao gồm: kính hiển vi, cân kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô trùng Laminar của Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc ở các nhiệt độ khác nhau, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf, máy PCR, máy soi DNA, máy điện di Bio-Rad, máy chụp ảnh Gel-Doc, tủ lạnh các loại 40C, -200C, -800C, máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, lò vi sóng, pipet man của hãng Eppendorf, bình nón, đầu côn, ống ly tâm v.v.
4.1.1.4. Phương pháp nghiên cứu
a) Làm giàu và phân lập vi sinh vật sinh metan - Làm giàu vi sinh vật
Bổ sung 5ml bùn kỵ khí vào 45 ml môi trường trong ống nghiệm kỵ khí. Đậy kín bằng nút cao su, ống được bọc kín bằng giấy mầu đen và nuôi cấy trong tủ ấm ở 250C, khi thấy bọt khí metan sinh ra, chuyển 5ml dịch đã được làm giàu sang môi trường làm giàu mới. Lặp lại 5 lần như trên, sau đó 1 ml dung dịch đã được làm giàu vi khuẩn metan được lấy ra nhỏ vào ống thạch nghiêng có thành phần môi trường như trên và được bổ sung thêm 0.05M Na-cetate và vancomycin (100mg/lit), Vancomycin có tác dụng ức chế các vi sinh vật không sinh metan.
- Phân lập vi sinh vật
Mẫu bùn được pha loãng sau đó cấy trên môi trường thạch có nguồn cacbon duy nhất là kitin. Đĩa thạch được nuôi ở 300C trong 48 giờ rồi đem phân tích và tách các khuẩn lạc tạo thành. Các khuẩn lạc được cấy chuyển lên môi trường tương ứng và tinh sạch.
Tuyển chọn vi sinh vật có hoạt tính sinh học: Các chủng vi sinh vật thuần khiết đã phân lập được cấy trên môi trường thạch với môi trường chọn lọc có chứa cơ chất kitin. Sau 48h tiến hành kiểm tra vòng phân giải tạo thành trên đĩa thạch
bằng thuốc thử thích hợp. Các chủng vi khuẩn tạo vòng phân giải lớn trên đĩa thạch sẽ được giữ giống lại để tiến hành nghiên cứu tiếp.
- Xác định số lượng vi sinh vật
Các mẫu nước được pha loãng bằng nước muối 0,85% trong điều kiện vô trùng. Nồng độ pha loãng theo cơ số mũ 10: 10-1, 10-2,....
Nhỏ 100 (l pha loãng được cấy lên các đĩa thạch chứa môi trường tương ứng với mỗi nhóm vi sinh vật. Gạt đều cho khô mặt thạch, sau đó ủ ở 28-300
C trong từ 24 –48 giờ. Đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành trên các đĩa thạch và tính toán số lượng vi sinh vật trong 1 ml nước theo công thức
N = C/(n1+n2*10-1+…+nn*10(n-1))*d*m (CFU/ml)
Trong đó
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các ống nghiệm n1: Số khuẩn lạc trong ống nghiệm ở tỉ lệ pha loãng lần 1 n2: Số khuẩn lạc trong ống nghiệm ở tỉ lệ pha loãng lần 1 nn: Số khuẩn lạc trong ống nghiệm ở tỉ lệ pha loãng lần 1 d: Tỉ lệ pha loãng
m: Lượng lấy mẫu ban đầu (ml)
b) Nhận dạng chủng vi khuẩn ky khí - Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn
* Phương pháp nhuộm Gram cải tiến như sau:
+ Chuẩn bị chủng vi khuẩn sạch: các chủng được nuôi cấy trên môi trường thạch đã nêu ở trên.
+ Tím kết tinh được nhỏ để làm vết bôi và để trong 1 phút.
+ 1-2 giọt dung dịch (lugol) được bổ sung và giữ 30 giây đến 1 phút. Tiêu bản được tẩy màu bằng cồn 95% có chứa iot trong khoảng 30 giây.
+ Tiêu bản được nhuộm bổ sung safranin từ 30 giây đến 1 phút, sau đó được rửa bằng nước, thấm, hong khô.
+ Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100 lần dưới vật kính dầu.
Kết quả: Nếu vi khuẩn bắt màu xanh tím thuộc loại Gram (+) còn bắt màu hồng là Gram (-). Vi khuẩn sử dụng làm đối chứng cho nhóm Gram (-) là E. coli và
Gram (+) là Bacillus.
* Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi điện tử
Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng trong 48h để đạt đến pha sinh trưởng. Mẫu sau đó được đem đi quan sát hình dạng kích thước tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét S4800. Hình thái tế bào vi khuẩn được chụp ảnh và đo kích thước. Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Công nghệ môi trường.
- Tách chiết ADN tổng số
Việc tách chiết ADN tổng số được thực hiện theo các bước sau: + Vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 500C trong môi trường BM;
+ Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào; + 1 ml dung dịch P1 được bổ sung để hòa tan tủa tế bào (Tris HCl 25 mM pH 8, EDTA 10 mM pH 9, glucose 50 mM). Sau đó 50 μl lysozyme 20 mg/ml được thêm vào, trộn đều và ủ ở 37oC trong 30 phút;
+ 50 μl SDS 20% được bổ sung, trộn đều và để ở nhiệt độ thường khoảng 10 phút, thỉnh thoảng lại được trộn đều;
+ Khoảng 3-4 μl Rnase được bổ sung, để ở nhiệt độ thường khoảng 10 phút; + 1 thể tích tương đương hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol tỉ lệ 25:24:1 được bổ sung, lắc mạnh bằng vortex trong 30 giây. Sau đó được ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 15 phút, phần dịch lỏng ở phía trên được hút ra và chuyển vào ống khác;
+ Khoảng 1/10 thể tích dung dịch CH3COOK 3M, pH 5,2 được thêm vào, trộn đều, sau đó 2,5 thể tích ethanol tuyệt đối để lạnh được bổ sung, lắc đảo ống khoảng 10 lần và giữ ở -200C trong 15-20 phút. Sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 25 phút để thu kết tủa AND;
+ Kết tủa được rửa bằng ethanol lạnh 70% và được ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 7 phút
+ Mẫu được làm khô tự nhiên trong khoảng 30 phút, được hòa tan trở lại bằng H2O khử ion đã khử trùng;
+ Sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp điện trên gel agarose 1%.
+ Phương pháp này cho phép xác định một cách tương đối nồng độ ADN đồng thời kiểm tra độ tinh sạch của mẫu ADN tách chiết bằng cách đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 260 nm và 280 nm;
