Phương pháp xác định hàm lượng amylose
Tiến hành theo phương pháp Cagampang và Rodriquez (1980) Quy trình thực hiện gồm 4 bước:
Bước 1:
Chuẩn bị dung dịch: Ethanol 95%, HCl 30%, NaOH 1N, dung dịch Iod (0,2% I và KI 2%)
Bước 2:
Chuẩn bị mẩu.
Cân 50 mg bột gạo đã được nghiền mịn, cho vào ống 50 ml Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều
Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Đun sôi trong 10 phút và lắc đều Để qua đêm ở nhiệt độ phòng
Bước 3:
Pha loãng và đo mẫu
Rút 100 µl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100 µl NaOH 1N)
Thêm nước cất khoảng ½ bình và lắc đều Thêm 250 µl 30% và lắc đều
Thêm 250 µl dung dịch Iod và lắc đều Thêm nước cất đến vạch định mức
Chuyển sang ống 50 ml, lắc đều để yên trong 30 phút
Lắc đều trước khi cho vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 580 nm
Bước 4:
Dựng đường chuẩn và tính kết quả Đường chuẩn có dạng: Y = aX + b Trong đó: Y: Độ hấp thụ OD
14 Tính hàm lượng amylose theo công thức: % Amylose =
2
X
×100
Đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) được trình bày như ở Bảng 2.2
Bảng 2.2 Phân nhóm lúa theo hàm lượng amylose (IRRI, 1988)
STT Phân nhóm Amylose (%) Cấp độ
1 Nếp 1 – 2 Rất thấp
2 Dẻo 8 – 20 Thấp
3 Mềm cơm 21 – 25 Trung bình
4 Cứng cơm >25 Cao
Phương pháp xác định hàm lượng protein
Tiến hành theo phương pháp Lowry O.H. (1951) Quy trình thực hiện gồm 4 bước:
Bước 1:
Chuẩn bị dung dịch ly trích: Dung dịch NaOH 0,1N
Dung dich A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,005% + NaOH 0,1N) Dung dịch B (CuSO4 0,1%)
Dung dịch C (45 ml dung dich A + 5 ml dung dịch B) Dung dich Folin 1N
Bước 2:
Chuẩn bị mẫu
Cân 10 mg bột gạo đã nghiền mịn cho vào ống nghiệm 1,5 ml sau đó thêm vào 1 ml NaOH 0,1N
Lắc ít nhất 2 giờ hoặc để qua đêm
Bước 3:
Pha loãng mẫu và đo
Ly tâm mẫu 14000 vòng/phút trong 3 phút
Hút 50 µl mẫu + 5 ml dung dịch C. Đối với blank thay dung dịch ly trích bằng 50 µl NaOH 0,1N
Trộn đều và để yên trong 10 phút
Thêm 50 µl Folin 1N, trộn đều và để yên trong 30 phút
15
Bước 4:
Dựng đường chuẩn và tính kết quả
Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA) Đường chuẩn có dạng: Y = Ax + b
Trong đó: Y: Độ hấp thụ OD
X: Lượng protein có trong mẫu đem đo Hàm lượng protein được tín theo công thức:
Công thức: %P = X/100×100
Phương pháp xác định cấp độ trở hồ
Xác định cấp độ trở hồ theo phương pháp của IRRI (1979)
Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy 6 hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt để vào đĩa petri
Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa
Đậy đĩa petri, để yên trong 23 giờ ở nhiệt độ phòng
Đánh giá độ lan rộng vào độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1979) được trình bày ở Bảng 2.3
Bảng 2.3 Bảng phân cấp độ độ trở hồ (IRRI, 1979)
Cấp Độ lan rộng
1 Hạt gạo còn nguyên
2 Hạt gạo phòng lên
3 Hạt gạo phòng lên; viền còn nguyên hay rõ nét
4 Hạt gạo phòng lên; viền còn nguyên và nở rộng
5 Hạt rã ra; viền hoàn toàn nở rộng
6 Hạt tan ra hòa chung với viền
7 Hạt tan hoàn toàn và quyện vào nhau
Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức:
Cấp trở hồ = Xi n N Trong đó: Xi: cấp độ trở hồ n: số hạt có cấp độ trở hồ xi N: số hạt thử nghiệm
Cấp độ trở hồ được đánh giá theo thang điểm của IRRI (1979)
Bảng 2.4 Thang đánh giá cấp độ trở hồ của IRRI (1979)
16
1 – 3 Cao
4 – 5 Thấp
6 – 7 Trung bình
Phương pháp xác định độ bền thể gel Theo phương pháp của Tang et al., (1991)
Bước 1:
Chuẩn bị mẫu
Tách vỏ trấu và đo độ ẩm hạt gạo
Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%)
Bước 2:
Hòa tan mẫu
Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% themol blue Thêm 2 ml KOH 0,2 N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (ở 1000C )
Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 10 phút Bước 3:
Đọc và ghi kết quả
Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ, sau 1 giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel)
Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm của IRRI (1996)
Bảng 2.5 Bảng phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996)
Cấp
Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel
1 80 – 100 Rất mềm
3 61 – 80 Mềm
5 41 – 60 Trung bình
7 35 – 40 Cứng
9 <35 Rất cứng
17
Đo chiều dài và chiều rộng của mỗi giống/dòng bằng cách xếp nối tiếp nhau trên giấy kẻ li, lấy giá trị trung bình. Đánh giá theo tiêu chuẩn của IRRI (1988).
Bảng 2.6 Phân loại hạt gạo theo chiều dài và tỉ lệ dài/rộng (IRRI, 1988)
Thang điểm Dài hạt Dài/rộng Dạng hạt Chiều dài hạt (mm) Dạng hạt Tỉ lệ dài/rộng (mm)
1 Rất dài > 7,5 Thon dài > 3,0
3 Dài 6,61 – 7,5 Trung bình 2,1 – 3,0
5 Trung bình 5,51 – 6,6 Hơi tròn 1,1 – 2,0
7 Ngắn < 5,51 Tròn < 1,0
Phương pháp thử thơm
Trắc nghiệm tính thơm bằng KOH 1,7% (IRRI, 1988) Quy trình thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
- Lấy khoảng 30 – 40 hạt gạo cho vào ống nghiệm 15 ml
- Bơm vào mỗi ống nghiệm 5 ml KOH 1,7%, đậy kín ống nghiệm bằng giấy bạc
Bước 2: Đun và ngửi mùi
- Cho ống nghiệm vào Waterbath đun ở 500C trong 30 phút
- Sau đó đem ra ngửi mùi (5 người ngửi ở 3 mức độ: thơm, thơm nhẹ, không thơm, tính kết quả trung bình)
- So sánh kết quả và cho kết luận sau cùng
Đánh giá độ thuần bằng phương pháp điện di protein tổng số SDS – PAGE Quy trình thực hiện gồm 5 bước:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
- Lấy 3 mg nội nhũ (phần không có phôi) nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml - Thêm vào 100 µl dung dịch ly trích
- Lắc ít nhất 3 giờ hoặc để qua đêm - Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút
18
- Tùy theo chiều dài chiều rộng và độ dày của khuôn là gel - Đổ gel theo quy trình của Sambrook (1989)
- Cài lược giữa hai tấm kính của gel để tạo giếng, thêm một giọt nước. Để yên 30 - 60 phút, loại bỏ răng lược, lắp vào khuôn điện di, cho dung dịch đệm điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.7 Công thức pha dung dịch gel
Hóa chất (1 gel) Gel phân tách 12% (ml) Gel cô mẫu 5% (ml)
Nước cất 1,6 0,68 Acrylamide 30% 2,0 0,17 Tris HCl (pH = 8.8) 1,5M 1,3 - Tris HCl (pH = 6.8) 1M - 0,13 SDS 10% 1,1 0,03 Amonium persulfate 10% 0,05 0,01 TEMED 0,002 0,001
Bước 4: Tiến hành điện di
- Bơm 10 µl dung dịch ly trích mẫu/giếng
- Chay điện di với hiệu điện thế 20V ở gel cô mẫu và 40V ở gel phân tách
Bước 5: Nhuộm và rửa gel
- Gel được nhuộm trong 2 giờ bằng dung dịch nhuộm 0,2% Coomassie Brilliant Blue R250
- Rửa gel bằng microwave trong 30 phút
Bước 6: Đọc kết quả, scan và bảo quản mẫu gel.
Phương pháp thử rầy
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bao gồm 8 nghiệm thức (giống chuẩn nhiễm TN1, giống chuẩn kháng BTP33)
Chuẩn bị khay nuôi rầy: Khay dùng nuôi rầy có chiều dài 30 cm, rộng 15 cm. Trồng giống TN1 làm thức ăn cho rầy, mỗi khay trồng 5 – 7 bụi. Những khay này được đặt trong tủ kiếng. Thời gian nuôi rầy là 30 ngày, trong thời gian nuôi rầy cần chú ý ẩm độ trong và ngoài khay để tạo điều kiện cho rầy phát triển.
Sau khi chuẩn bị khay nuôi rầy, tiến hành bắt rầy cái có bụng to thả vào. Số lượng rầy cái thả vào tùy thuộc vào lượng giống trắc nghiệm và mật độ thả vào. Thông thường, một con rầy cái cánh ngắn có thể đẻ 300 – 400 trứng, rầy cái cánh dài có thể đẻ 100 trứng.
Chuẩn bị lúa trắc nghiệm: Hai ngày sau khi thử rầy, tiến hành gieo lúa trắc nghiệm (đã được ngâm 24 giờ, ủ 48 giờ trước đó) vào khay nhựa 30 × 25 cm, có chứa sẵn một lớp đất dày 5 cm. Cách trồng như sau: mỗi hàng trồng 15 hạt và mỗi giống/dòng sẽ là một hàng. Đặt khay lúa vào tủ sau đó thêm nước ở đáy tủ lớp nước khoảng 2 – 3 cm để tạo ẩm độ và tránh côn trùng gây hại.
19
Thả rầy: khi lúa ở các nghiệm thức được 2 – 3 lá thật (5 – 7 ngày tuổi), tiến hành bắt rầy tuổi 1 – 2 thả vào, mật số 5 – 7 con/cây. Rầy được thả vào bằng cách cắt ngang cây lúa sau đó gõ nhẹ.
Theo dõi và lấy chỉ tiêu khi giống chuẩn nhiễm chết. Khả năng kháng rầy được đánh giá theo tiêu chuẩn quốc tế (Standard Evaluation System for Rice, 1980) ở Bảng 2.8.
Bảng 2.8 Phân cấp và đánh giá tính nhiễm rầy của lúa theo IRRI (1996)
Cấp Triệu chứng bệnh Tính chống
chịu
0 Không bị thiệt hại Rất kháng
1 Vài cây hơi vàng Kháng
3 Lá vàng thật sự nhưng chưa cháy rầy Hơi kháng
5 Lá vàng thật sự, một vài lá chết và có 10 – 25 % chồi bị cháy rầy Hơi nhiễm
7 Hơn 50% số chồi chết còn lại những chồi khác bị lùn Nhiễm
20
CHƯƠNG 3:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tiến hành ngâm ủ và trồng cây cha mẹ. Đến khi cây mẹ bắt đầu trổ bông tiến hành khử đực vào chiều ngày 19/03/2013 và thụ phấn vào sáng ngày 20/03/2013.
Sau quá trình lai tạo thu được 10 hạt lai F1 và tổ hợp lai này được quy ước là THL24.