ch p íc 48 Đ•ờng chuẩn của D2 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Nồng độ D H ỡ n h 3 . 3 : Đƣờng chuẩn Crotonkin - 3
Dựa vào phương phỏp bỡnh phương tối thiểu và cỏc số liệu ở bảng 3.5 đó thu được cỏc hệ số trong phương trỡnh hồi qui của Crotonkin -3 cú
a = 567,63 ; b = 29, 16 và hệ số tương quan R = 0,9740 Vậy phương trỡnh tương quan của Crotonkin -3
là: Y = 567,63 . XD-2 + 29,16
y: Diện tớch pic thu được trờn phổ LC -MS XD-2: Hàm lượng (mg/ml) của Crotonkin -3
Cũng như Crotonkin -1 và Crotonkin -2 tớnh ổn định cao trong cỏc lần đo Crotonkin -3 lặp lại cũng như sự tương quan chặt chẽ giữa cỏc nồng độ chất chuẩn và diện tớch thu được ở trờn phổ LC -MS được phản ỏnh bởi hệ số tương quan R trong phương trỡnh tương quan của Crotonkin -3 (0,9740) là rất cao.
3.3.4. Xỏc định hàm lượng Crotonkin -1 và Crotonkin -2 trong cõy Khổ
sõm
Cõn lấy một khối lượng nguyờn liệu (M) ngõm chiết và thu cặn chiết
giàu ent -kauran (m). Cõn chớnh xỏc 1mg cặn chiết và ghi trờn mỏy LC -MS. Từ phương trỡnh tương quan (y = ax + b) và diện tớch tớch phõn LC -MS
49
của mỗi chất sẽ tớnh được khố i lượng của chất đú trong 1mg cặn chiết (m) và hàm lượng (%)của Crotonkin trong nguyờn liệu tớnh theo cụng thứcc:
% crotonkin = yCT - b x m x 100 (3.1)
a M
Trong đú yCT: diện tớch tớch phõn trờn phổ đồ LC -MS ứng với Rt của Crotonkin
a, b: Cỏc hệ số trong phương trỡnh tương quan của crotonkin Crotonkin-1 cú a = 7109,85, b = 126,87
Crotonkin-2 cú a = 6657,28, b = 15,48
m: cặn chiết giàu ent -kauran thu đựơc từ khối lượng M M: khố i lượng nguyờn liệu đem phõn tớch.
Vớ dụ cỏch tớnh: 200g (M) lỏ khụ nghiền nhỏ thu hồ i thỏng 5/2007 ở Súc Sơn - Hà Nộ i được ngõm chiết kiệt, làm giầu ent -kauran thu được 23, 4g cặn thụ. Cõn chớnh xỏc 1mg cặn chiết và đưa phõn tớch trờn mỏy LC -MS thu được sắc ký đồ ký hiệu M107.
Trờn sắc ký đồ M107 cho biết d iện tớch tớch phõn LC -MS tương ứng với Rt của Crotonkin như sau: yCT Rt
Crotonkin-1 388,463 23,96 Crotonkin-2 196,815 21,60 Thay bằng số vào cụng thức (3.1) ta cú: % crotonkin-1 = 388,463-126,87x 23,4 x 100 = 0,43 7109,86 200 % crotonkin-2 = 196,815-15,48 x 23,4 x 100 = 0,32 6657,28 200
50
3.3.4.1. Xỏc định hàm lượng của crotonkin trong lỏ và cành Khổ sõm theo cỏc thời điểm khỏc nhau 3
Theo dừi sự biến động hàm lượng cỏc Crotonkin -1 và Crotonkin -2 trong cành và lỏ cõy Khổ sõm trồng ở Súc Sơn - Hà Nội cho kết quả ghi trong bảng 3.6
B ả n g 3 . 6 : Hàm lƣợng Crotonkin chủ yếu của lỏ và cành Khổ sõm thu ở
Súc Sơn - Hà Nội theo một số thời điểm trong năm
STT Thời gian lấy mẫu Bộ phận Hàm lƣợng (%)
Crotonkin-1 Crotonkin-2 1 4/2007 Lỏ 0,335 0,192 2 Cành 0,062 0,048 3 5/2007 Lỏ 0,430 0,320 4 Cành 0,360 0,350 5 11/2007 Lỏ 0,520 0,560 6 Cành 0,530 0,530
3.3.4.2. Xỏc định hàm lượng của Crotonkin chủ yếu của lỏ Khổ sõm ở cỏc vựng sinh trưởng khỏc nhau 3
B ả n g 3 . 7 : Hàm lƣợng một số ent -kauran chủ yếu của lỏ Khổ sõm thu ở
một số vựng khỏc nhau Bộ phận
cõy Địa điểm Thời gian thu mẫu
Hàm lƣợng (%) Crotonkin-1 Hàm lƣợng (%)Crotonkin-2 Lỏ Súc Sơn 5/2007 0,43 0,32 Lỏ Ninh Bỡnh 5/2006 0,74 0,50 Lỏ Phỳ Thọ 9/2007 0,73 0,78 Lỏ Ninh Bỡnh 0,80 0,70 Lỏ Súc Sơn 11/2007 0,52 0,56 Lỏ Hưng Yờn 0,75 0,50
51
MS (xem phụ lục). Sau khi xử lý số liệu đó thu kết quả phõn tớch hàm lượng Crotonkin -1 và Crotonkin -2 theo cỏc thời điểm trong năm (bảng 3.6) và theo vựng nguyờn liệu (bảng 3.7). Đỏnh giỏ cỏc số liệu trong 2 bảng này đó quan sỏt thấy hàm lượng cỏc Crotonkin chủ yếu của cõy Khổ sõm cú sự biến động rừ rệt:
Hàm lượng của cỏc Crotonkin trong cõy tăng dần từ mựa xuõn hố và đạt mức cao nhất vào mựa thu hàng năm. Hàm lượng Crotonkin -1 trong mựa xuõn hố luụn cao hơn Crotonkin -2 từ 1, 74 đến 1, 34 lần ở l ỏ, và từ 1, 29 đến
1, 03 lần ở cành, nhưng sang mựa thu thỡ chờnh lệch khụng đỏng kể.
Những số liệu phõn tớch ban đầu cho thấy: lỏ cõy khổ sõm thu ở cỏc vựng trung du (Bắc Giang, Phỳ Thọ, Ninh Bỡnh) cú hàm lượng ent -kauran luụn cao hơn những cõy trồng ở Súc Sơn - Hà Nội.
Từ những kết quả nghiờn cứu sơ bộ về sự biến động hàm lượng hoạt chất của cõy Khổ sõm đó cú cơ sở để núi rằng: nguyờn liệu tốt nhất để chiết xuất Crotonkin -1 và Crotonkin -2 là dựng lỏ cõy Khổ sõm ở vựng trung du thu hỏi vào mựa thu hằng năm.
Đó xõy dựng được phộp định lượng đồng thời hàm lượng Crotonkin- 1 và Crotonkin-2 trong hỗn hợp. Xác định đ•ợc thời điểm thu nguyên liệu để chiết xuất hoạt chất chính.
52
4. KẾT LUẬN
1. Đó xỏc định được cỏc điều kiện thớch hợp đối với phương phỏp LC /MS để phõn tớch một số ent -kauran ditecpen chớnh làm cơ sở cho việc định lượng đồng thời cỏc ditecpen toàn phần cú trong hỗn hợp nghiờn cứu.
2. Đó xõy dựng phương phỏp định lượng Crotonkin -1, Crotonkin-2, Crotonkin-3 đỏp ứng cỏc yờu cầu nhanh, nhậy, chọn lọc và cho phộp định lượng đồng thời hàm lượng Crotonkin -1 và Crotonkin -2 trong hỗn hợp.
3. Áp dụng phương phỏp LC /MS để phõn tớch 18 mẫu nguyờn liệu cú chứa ent -kauran ditecpen chớnh là Crotonkin -1 và Crotonkin -2.
4. Cỏc số liệu phõn tớch thành phần Crotokin -1 và Crotonkin -2 thu
được ở một số thời điểm khỏc nhau cho biết nguyờn liệu tốt nhất để chiết xuất là dựng nguyờn liệu thu hỏi vào mựa thu hàng năm.
53
5. DANH MỤC CÁC CễNG TRèNH ĐÃ CễNG BỐ
LIấN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Pham Thi Hong Minha, Nguyen Quyet Tiena , Nguyen Ngoc Tuana, Pham Hoang Ngoca, Ngo Van Quanga, Nguyen Xuan Hoangb.
“Quantitative Determination of two diterpeno ids in Croton tonkinensis
Gagnep., by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Diode
Array Detector and Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry”. International scientific conference on “Chemistry for development and intergration”. 30th Anniversary of the Institute of Chemistry Vietnam Academy of Science and Technology. Setember 12-14, 2008. Hano i, Vietnam.
54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vừ Văn Chi (1997), Từ điển cõy thuốc VN trang 622-623, Nhà xuất bản Y học TP Hồ Chớ Minh
2. Phạm Hoàng Hộ (1991), "Cõy cỏ Việt Nam", Mekong Printing.
3. Đỗ Tất Lợi (1999), "Những cõy thuốc và vị thuốc Việt Nam", (in lần thứ 8), trang 907-908, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
4. Phạm Thị Hồng Minh “Về thành phần hoỏ học và cỏc hoạt c hất của cõy
Khổ sõm cho lỏ (Croton tonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae“. Luận ỏn tiến sĩ hoỏ học, Hà Nội 12/2003. 5. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc (2002), "Phõn lập và
nhận dạng cỏc triterpen acetat trong cõy Croton tonkinensis",
Tạp chớ Dược học, 2002, 12, 8-9. 6. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Trần Quang Hưng, Chu Đỡnh Kớnh (2003), "Phỏt hiện cỏc berbin alcaloit trong cõy khổ sõm cho lỏ (Croton tonkinensis",
Tạp chớ Phõn tớch lý, hoỏ, sinh, 2004, 9 (1), 38-41. 7. Phạm Thị Hồng Minh, Lưu Thị Huế, Phạm Hoàng Ngọc, Phạm Hữu Điển (2006), “Gúp phần nghiờn cứu thành phần ancalo it trong cõy Khổ sõm cho lỏ (Croton tonkinensis) ở Tõy Thiờn -Tam Đảo ”.
Tạp chớ khoa học Trường ĐHSP Hà Nội, cỏc KHTN 2006, 4 trang 110-114. 8. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Chu Đỡnh Kớnh (2004),
"Phõn lập và nhận dạng một số flavonoit -C-glucosid từ cõy khổ sõm cho lỏ (C. tonkinensis) cú ở Việt nam"
Tạp chớ Hoỏ học , 2004, 42 (2), 187-190. 9. Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Lan, Phạm Hữu Đ iển, Nguyễn Quyết
55
trong cõy Khổ sõm cho lỏ (Croton tonkinensis) thu hỏi ở Ninh
Bỡnh”.
Hội Nghị Hoỏ học Hữu cơ Toàn quốc10 /2007,
10. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Đỏi Duy Ban, Lờ Kim Xuyến, Hoàng Thị Minh Chõu, Lờ Trung Dũng, Phan Xuõn Độc, Nguyễn Văn Vũ. "Kết quả nghiờn cứu khả năng tăng cường miễn dịch của cỏc chế phẩm khổ sõm Croton tonkinensis Gagnep.,"
Tạp chớ Y học Việt Nam, 2007, 333, 24-28 11. Chu Van Man. (2003). “Informatic applications in biology”. Tr 195-
201. National Univers ity of Hanoi Press 2003.
12. Trương Văn Như. Nghiờn cứu cõy Khổ sõm cho lỏ (Croton tonkinensis)
và đỏnh giỏ tỏc dụng trờn ký sinh trựng sốt rột bằng phương phỏp thực nghiệm.
Luận văn PTS khoa học y dược. Hà nội 1992. 13. Nguyễn Nghĩa Thỡn (1995), "Họ thầu dầu (Euphorbiaceae Juss. trong
hệ thực vật Việt Nam",
Tạp chớ Sinh học, 17(4), 7-30. 14. Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng, Phan Minh G iang, Taylor W. C (1999), "Đúng gúp vào việc nghiờn cứu hoạt chất sinh học từ cõyKhổ sõm cho lỏ Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae".
Tạp chớ Hoỏ học, 27(4), tr. 1-2. 15. Pham Thi Hong Minh, Pham Hoang Ngoc, Đang Ngoc Quang,
Hashimoto
T., Takaoka S., Asakawa Y (2003), "A novel ent-1 -acetoxy- 7 ,14 -dihydroxy-16-kauren-15-on from the Croton tonkinensis",
56
16. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc (2003), "ent-(16S)-7 -hydroxy-
18-acetoxy kauran-15-on - một kauran d iterpen mới, phõn lập từ cõy khổ sõm cho lỏ Croton tonkinensis",
Tạp chớ Hoỏ học, 41(2), 104-109. 17. Perry N. B., Burgess E. J., Back S. H., Weavers R. T., Geis W., Manger A.
B., (1999). "11-Oxygenated cytotoxic 8,9-secokauranes from a New
Zealand liverwort, Lepidolarena tayloric ".
Phytochemistry, 50 (9), 423-433. 18. Phan Minh Giang, Hui Zi Lin, Phan Tong Son, Jeong Hyuny Lee, Yuong Soo Hong and Jung Joon Lee. (2003). Ent-kauran d iterpeno ids from Croton tonkinensis inhib it LPS-inđuce NF -kB activation and no production.
J. Nat. Prod., 66 (9), 1217-1220. 19. Pham Thi Hong Minh, Pham Hoang Ngoc, Nguyen Manh Cuong, Taylor W. C, (2004). “A new ent-kauran d iterpenoid from
Croton tonkinensis Gagnep., leaves.”.
Fitoterapia, 75 (2), 552-556.
20. Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Lee, J. J., and Otsuka, H., (2004). “ent- kauran diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep.,”.
Chem. Pharm. Bull., 52 (7), 879-882.
21. Nagashima F., Kondoh M., Uematsu T., Nishiyama A., Saito S., Sato M., and Asakawa (2002). Chem. Pharm. Bull. 50, 808-813.
22. Gonzales A.G., Frega B.M., Hernandez M. G., Luis J. G., (1973).
Phytochemistry, 12, 2721-2723.
23. Monte F. J. G., Dantas E. M. G., Braz F. R., (1988).
Phytochemistry, 27, 3209-3212.
24. Phan Minh G iang, Hideakii Otsuka, Phan Tong Son. (2005). "The minor ent-kauran-16-en-15-on type diterpen from Croton tonkinensis".
57
58
25. Addae Mensah I., Achenbach H., Waib il R., and Mwangi J. W.
(1992), "Epoxychiromodine and other constitutents of Croton
megalocarpus"
Phytochem., 31(6), 2055-2058. 26. Barb ili F. E., Moulis C., Bon M. Respand M. J., Fouraste I.
(1998), "Three furanoditerpenes from the bark of Croton campestris”
Phytochem., 48(1), 165-169. 27. Cai Y., Chen Z. P., and Phillipson J. D. (1993), "Clerodane d iterpeno
ids from Croton lechleri"
Phytochem., 34(1), 265-268. 28. Chapman & Hall/CRC 1982-2006,From DNP on CD-ROM,Vers ion
15:1.
29. Chatterjee A., Banerjee A., and Bohlmann F. (1978), "Isocrotocaudin, a new norclerodans-type diterpene from Croton caudatus",
Phytochem., 17, 1777-1779. 30. Gelp i E., “Contributions of liquid chromatography-mass spectrometry to
“highlights” of biomedical research”.
J. Chromatogr. A, 1000, p. 567-581. (2000).
31. He X. G., “On-line identification of phytochemical constituents in botanical extracts by combined high-performance liquid chromatographic-diode array detection-mass spectrometric techniques”.
J. Chrom atogr. A, 880, p. 203-232
(2000).
32. Kapingu M. C., Guillaume D., Mbwambo Z. H., Moshi M. J., Uliso F.
59
Croton macrostachys"
58
33. Kitazawa E., Two diterpenes alcohols from Croton sublyratus. (1981),
Phytochem., 20(2), 287-289. 34. Krebs H. C., Ramiarantsoa H. (1996), "Clerodan diterpenes and
other constituents of Croton hovarum"
Phytochem., 41(2), 561-563. 35. LecomteH., “Flore general de L’Indochiene”, 1910 -1931. Tom
V., p.291.
36. Maciel M. A. M., Pinto A. C., Arruda A. C., Pamploma S. G. S. R., Vandelinde F. A., Lapa A. j., Echevarria A., ... Rao V. S. N. (2000), "Ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology: a successful combination in the study of Croton cajucara"
J. Ethnopharm., 70, 41-55. 37. Maciel M. A. M., Pinto A. C., Brabo S. N. and Silva M. D. A.
(1998), "Terpenoids from Croton cajucara"
Phytochem., 49(3), 823-828. 38. Martins A.P., Salguerio L.R., Goncalves M.J., Vila R., Tomi F.,
(2000).
Antimicrobial activity and chemical composition of the back oil of
Croton stellulifea, an endemic species from S. tome & Principe.
Planta Med., 66(7), 647-650. 39. Ngad jui B. T., Folefoc G. G., Keumedjio F., Dongo E., Sondengam
B.
L., Connolly J. D. (1999), "Crotonadiol, a labdane d iterpeno ids from the stem bark of Croton zambesicus"
Phytochem., 51, 171-174. 40. Nguyen Manh Cuong, Tran Van Sung, Ahn B.Z. (2002).
Cytotoxic compounds from Croton Cascarilloides. Kor.
59
41. Pelletier S. W. (1970). Chemistry of the alkalo ids. Van. Nostrand
Reiho ld company. Newyork/Toronto/London/Melburn., p. 31-82. 42. Peres M. T. L. P., Monache F. D., Cruz A. B., Pizzolati M. G., Yunes R.
A. (1997), "Chemical composition and antimicrobial activity of
Croton urucurana Baillon (Euphorbiacea)
J. Ethnopharm., 56, 223-226. 43. Piacente S., Belisario M. A., Castillo H. D., Pizza C., and Feo V. D. (1998), "Croton ruizianus: P latelet proaggregating activity of two new pregnane glucoside"
J. Nat. Prod., 61, 318-322. 44. Roengsumram S., Achayindee S., Petsom A., Vilaivani T. (1998),
"Two new cembrano ids from Croton oblongifolius"
J. Nat. Prod., 61, 652-654. 45. Vigor C., Fabre N., Fourastộ I and Moulis C. (2002),
Neoclerodane diterpeno ids from Croton eluteria
60 PHỤ LỤC 1. Phổ của Crotonkin -1 ... 1 1.1. Phổ IR... 1 1.2. Phổ MS ... 2 1.3. Phổ 1H-NMR ... 3 1.4. Phổ 3C-NMR và DEPT ... 4 2. Phổ của Crotonkin -2 ... 5 2.1. Phổ IR... 5 2.2. Phổ 1H-NMR ... 6 2.3. Phổ 3C-NMR ... 7 2.4. Phổ DEPT ... 8 3. Phổ của Crotonkin -3 ... 9 3.1. Phổ IR... 9 3.2. Phổ MS ... 10 3.3. Phổ 1H-NMR ... 11 3.4. Phổ 3C-NMR ... 12 4. Phổ của Crotonkin -5 ... 13 4.1. Phổ 1H-NMR ... 13 4.2. Phổ 3C-NMR ... 14 4.3. Phổ DEPT ... 15
5. Cỏc số liệu phõn tớch phổ LC /MS và đường chuẩn của Crotonkin -1 ...
16 6. Cỏc số liệu phõn tớch phổ LC /MS và đường chuẩn của Crotonkin -2 ...
32 7. Một số đại diện phổ LC /MS của mẫu thu tại Súc Sơn ...
48 7.1. Phổ LC /MS của mẫu lỏ khổ sõm thu 5/2007 ... 48
7.2. Phổ LC /MS của mẫu cành khổ sõm thu 5/2007 ... 50
7.3. Phổ LC /MS của mẫu lỏ khổ sõm thu 4/2007 ... 52
7.4. Phổ LC /MS của mẫu cành khổ sõm thu 4/2007 ... 54
7.5. Phổ LC /MS của lỏ khổ sõm thu tại Ninh Bỡnh vào thỏng 5/2007 ....
56 7.6. Phổ LC /MS của cành khổ sõm thu tại Ninh Bỡnh 5/2007 ... 58
8. Cỏc số liệu phõn tớch phổ LC /MS và đường chuẩn của Crotonkin -3 ... 60
61
9. Một số đại diện phổ LC /MS của mẫu thu tại Tờn Yờn-Bắc Giang...72