III. Thành tựu và hướng phát triển:
f. Nuôi cấy protoplasts tạo giống khoai tây:
• Phương pháp chiết tách protoplast:
• Phương pháp chiết tách protoplast:
- Sức trương của tế bào sống là luôn cân bằng với áp lực cơ học của thành tế bào. Khi tách vỏ tế bào bị vỡ khi không còn lực nén của vỏ.
- Để khắc phục hiện tượng này cần phải sử dụng một dung dịch để co nguyên sinh khi tách vỏ tế bào các dung dịch thường dùng là dung dịch đường manitol, sorbitol.
- Enzyme sử dụng để phá vỡ màng tế bào: Cellulase
và Macerozyme chiết xuất từ nấm Trichdearina virde
và Aspergillus niger Pectinas.
- Nồng độ dung dịch enzyme sử dụng tùy thuộc đối tượng.Các hỗn hợp enzyme thường sử dụng ở PH 5.5 đến 5.8 trong 3 đến 8 giờ.
- Thông thường cơ quan thực vật dùng để tách protoplast là lá.
- Lá được cắt nhỏ trong dung dịch gây co nguyên sinh ủ trong dung dịch hỗn hợp emzyme.
- Sau khi ủ các protoplast được tách qua hệ thống phiễu lọc (<50um).
- Sau khi rửa sạch các enzyme bằng cách ly tâm trong các dung dịch rửa khác nhau, ta thu được protoplast (từ 1 gram lá khoai tây có thể thu từ 6 đến 12 triệu protoplast).
- Các protoplast, thậm chí khác loài, có thể kết hợp với nhau tạo tế bào lai và qúa trình này gọi là sự
dung hợp protoplast.
• Sự dung hợp protoplast:
+ Dung hợp bằng hóa chất:
Thường sử dụng polyethylenglycol (PEG 5-25%) là chất có tác dụng dính kết tế bào trần dể dung hợp chúng.
+ Dung hợp bằng điện:
• Đưa dung dịch hỗn hợp protoplast (2 bản cực được thiết kế trong các hộp dung hợp).
• Các protoplast sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm giữa 2 bản cực.
• Khi có 1 xung điện cao (750-1000V) trong 1 thời gian rất ngắn (1-200 mili giây) vùng tiếp xúc giữa 2 màng tế bào sẽ bị vỡ.
• 2 protoplast hòa nhập vào nhau-quá trình dung hợp sẽ xảy ra.
• Qui trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast:
• Qui trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast:
-Sau một thời gian nuôi cấy một đến hai tuần các protoplast tái tạo vỏ và phân chia tạo nên các microcallus.
-Chuyển các microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các mô sẹo.
-Từ đó chuyển sang môi trường tái sinh chồi và cây hoàn chỉnh.
Melchers với thành tựu dung hợp thành công tế bào trần khoai tây với tế bào trần cà chua đã đánh dấu 1 mốc rất quan trọng trong lĩnh vực này.
Ngày nay việc sử dụng kĩ thuật dung hợp tế bào trần đã được ứng dụng rộng rãi vào các hệ thống tạo giống.