2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu thực vật được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm ở Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Mát, Nghệ An vào tháng 3/2013 và được PGS.TS. Trần Huy Thái, phòng Thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định danh.
Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C. Mẫu khi khô được xay nhỏ đến kích thước 1,5x1,5 mm để thuận tiện cho trích xuất các hoạt chất ra khỏi tế bào. Sau khi xay, mẫu được trích ly rắn- lỏng bằng dung môi methanol theo phương pháp trích ly một bậc. Cất thu hồi dung môi thu được cao chiết methanol. Cao chiết methanol được phân bố vào nước chất, chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm.
2.1.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các chất
Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sẽ sử dụng các phương pháp sắc ký như:
- Sắc ký khí - khối phổ ký liên hợp (GC-MS). - Sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Cột thường (CC). - Sắc ký cột nhanh (FC).
- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ: - Phổ tử ngoại (UV).
- Phổ hồng ngoại (IR).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR. - Phổ COSY. - Phổ DEPT. - Phổ HMBC. - Phổ HSQC. 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Thiết bị 2.2.1.1. Hoá chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Dung môi được sử dụng là: n-hexan, metanol (CH-
3OH), butanol (C4H9OH), etylaxetat (CH3COOC2H5), axeton (CH3COCH3), clorofom (CHCl3), nước cất.
2.2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Máy đo điểm chảy (nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetius). Máy đo phổ tử ngoại UV.
Máy đo phổ hồng ngoại IR.
Phổ khối lượng EI-MS được ghi trên máy LC-MS-Trap-00127.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz. Phổ 13C-NMR, COSY, DEPT, HMBC, HSQC được đo trên máy Bruker 125 MHz.
2.2.2. Nghiên cứu các hợp chất từ quả cây Hồng bì
2.2.2.1. Phân lập các hợp chất
Mẫu quả cây Hồng bì rừng (Clausena dunniana H. Les) (5,0 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi metanol (10l x 3) ở nhiệt độ phòng, thu được dịch chiết được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay
cất chân không thu được cao metanol thô màu nâu (278,15 g). Cao metanol thô đươc phân bố trong nước và chiết lần lượt với dung môi n-hexan, cloroform, và butanol. Chưng cất chân không các dịch chiết tương tứng thu cao chiết n-hexan 86,7 (g), cao chiết cloroform 114,6 (g), cao chiết butanol 50,3 (g). Cao cloroform được sắc ký cột trên silica gel bằng n-hexan – axeton gradient nồng độ thu được 4 phân đoạn, phân đoạn 2 được phân tách qua sắc ký cột trên silica gel bằng gradient nồng độ cloroform – metanol thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn, phân đoạn C-2-2 sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi N/E 4:1 thu được hợp chất rắn, phân tích bằng sắc ký lớp mỏng thấy chất rắn còn lẫn tạp chất nên tiến hành sắc ký pha đảo (RP-18) với dung môi rửa giải methanol, thu được chất A. . (xem sơ đồ 2.1)
Phân đoạn C-2-4 sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi 10/M 6:1 thu được 3 phân đoạn. Phân đoạn C-2-4 sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi 10/M 6:1 thu được chất rắn, phân tích bằng sắc ký bản mỏng thấy còn lẫn tạp chất nên tiền hành sắc kí điều chế (PTLC) thu được hợp chất B (xem sơ đồ 2.1)
Sơ đồ 2.1. Phân lập hợp chất trong quả cây Hồng bì rừng
Cao cloroform
(114,6 g)
Cao butanol
(50,3 g) - Ngâm với metanol
- Cất thu hồi metanol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phân bố trong nước
- Chiết lần lượt với clorofom, butanol Quả Hồng bì rừng (5 kg). Cao metanol (278,15g) Cao hexan (86,7 g) C-2-4-1 C-2-4-2 C-2-4-3 B 11,3 mg D/M 7:1 C-1 C-2 C-3 C-4 CC, gradient C/M 30:1 đến 4:1 A (10,2) mg C-2-1 C-2-2 C-2-3 C-2-4 C-2-5
Chương 3