VSV phân giải các hợp chất cacbon thành ựường glucose. Lúc này ựường glucose sẽ phản ứng với axit cyanic (HCN) tạo thành muối xianua (C7H13C6N) không ựộc với môi trường. Hàm lượng các hợp chất cacbon luôn lớn hơn hàm lượng axit cyanic nên lượng ựường glucose tạo thành sẽ lớn hơn rất nhiều so với lượng chất ựộc axit cyanic (HCN).
PHẦN 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. đi t ng và phm vi nghiên cu
- Nước thải sau sản xuất của nhà máy sản xuất tinh bột sắn Ninh Bình. - Chủng VSV trong nghiên cứu do phòng Sinh học môi trường - Viện Môi trường Nông nghiệp cung cấp.
2.2. Ni dung nghiên cu
- đánh giá hoạt tắnh sinh học của 3 chủng VSV.
- Nghiên cứu khả năng sử dụng hỗn hợp VSV trong xử lý nước thải tinh bột sắn.
- Triển khai, bố trắ thắ nghiệm xử lý nước thải tinh bột sắn trong các bình tam giác 250 ml. Thắ nghiệm ựược tiến hành trong phòng thắ nghiệm của bộ môn Sinh học môi trường - Viện Môi trường Nông nghiệp.
Thắ nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 4 lần. đC : đối chứng trắng (200 ml nước thải tinh bột sắn). CT1 : Hỗn hợp VSV+ nền, ựược ựể nguyên không lắc CT2 : Hỗn hợp VSV+ nền, ựược cho vào máy lắc ựều.
Hỗn hợp VSV ựược bổ sung vào nước thải ở các tỉ lệ phần trăm khác nhau là 0,1%; 0, 2%; 0, 3% ; 0,4% ; kắ hiệu tương ứng với các tỉ lệ là T2, T4, T6, T8; sau ựó chọn ra tỉ lệ thắch hợp.
- Phân tắch một số chỉ tiêu về chất lượng nước thải tinh bột sắn trước thắ nghiệm, sau khi thắ nghiệm 3 ngày, 5 ngày.
- Bước ựầu ựánh giá về hiệu quả xử lý của hỗn hợp VSV.
Ba chủng VSV của viện Môi trường nông nghiệp, ựã ựược phân lập, tuyển chọn từ bã thải và nước thải tinh bột sắn hiện ựang ựược tiếp tục nghiên cứu. Chúng có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ, hợp chất chứa
Nitơ liên kết ... An toàn ựối với người và ựộng vật. Hiện, những chủng này ựang ựược gửi ựi ựể ựịnh danh cụ thể.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết bị, hoá chất và dụng cụ thắ nghiêm
Thiết bị, hoá chất và dụng cụ thắ nghiệm do phòng Sinh học môi trường Ờ Viện Môi trường nông nghiệp cung cấp. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu là các phương pháp thường qui ựược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu VSV.
* Thiết bị, hóa chất và dụng cụ thắ nghiệm
- Thiết bị sử dụng: Tủ sấy thanh trùng, nồi hấp thanh trùng, tủ ấm, máy lắc ổn nhiệt (150 vòng/phút), tủ cấy vô trùng, cân kỹ thuật, nhiệt kế.
- Dụng cụ thắ nghiệm: Bình tam giác, ống nghiệm, ựĩa peptri, que chang, que cấy, ựèn cồn, bôngẦ
* Thành phần môi trường ựược sử dụng trong nghiên cứu:
Môi trường kiểm tra vi sinh vật tổng số: Thạch thịt Ờ Pepton
Cao thịt 5g Pepton 10g NaCl 5g Glucose 10g Thạch 12g pH 6,8 Ờ 7,0 Nước cất 1000ml
Môi trường Gauze cho xạ khuẩn
Tinh bột tan 20,0g KH2PO4 0,5g MgSO4. 7H2O 0,5g
KNO3 1,0g
FeSO4 0,01g
Thạch 12g
Nước cất 1000ml
pH 6,8 Ờ 7,2
Môi trường Hansen cho nấm men
Glucoza 50,0g Pepton 10,0g K2HPO4. 3H2O 3,0g MgSO4. 7H2O 3,0g Thạch 12g Nước cất 1000ml pH 6,8 Ờ 7,1
Môi trường KingB cho Bacillus
Pepton 10g Glycerin 10g MgSO4. 7H2O 1,5g K2HPO4 1,5g Nước cất 1000ml pH 7,0 Ờ 7,2
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu nước thải ựược lấy về phân tắch ngay trong phòng thắ nghiệm. Quá trình lấy mẫu bằng tay và tuân thủ theo các yêu cầu, kỹ thuật lấy mẫu. đối với mẫu lấy ựể phân tắch các chỉ tiêu ựánh giá khả năng làm sạch nước thải của các công thức, ựề tài sử dụng pipet 5000ộl ựể hút mẫu ựem phân tắch.
2.3.3. Phân tắch tổng hợp các nguồn tài liệu và xử lý số liệu
2.4. Phương pháp phân tắch và các chỉ tiêu phân tắch
2.4.1. Kiểm tra mật ựộ vi sinh vật tổng số [11]
Hút 10ml mẫu vào bình tam giác dung tắch 250 ml có chứa 90 ml nước cất ựã khử trùng. Lắc trên mắy lắc với tốc ựộ 150 vòng/phút trong 30 phút, thu ựược dung dịch pha loãng có nồng ựộ 10-1. Sau ựó, hút 1ml dịch trong bình pha loãng có nồng ựộ 10-1 sang ống nước cất 9ml ựã khử trùng, ựược nồng ựộ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng như trên, ựược nồng ựộ pha loãng 10-2, 10-
4, ... ựến nồng ựộ pha loãng cần thiết. Hút 50 ộ l dịch ựã pha loãng nhỏ vào các hộp peptri chứa môi trường phù hợp với từng nhóm vi sinh vật cần kiểm tra.
(1)Kiểm tra mật ựộ vi sinh vật tổng số : Kiểm tra trên môi trường thạch thịt.
(2)Kiểm tra mật ựộ nấm men : Kiểm tra trên môi trường Hansen. (3)Kiểm tra mật ựộ xạ khuẩn : Kiểm tra trên môi trường Gause. (4)Kiểm tra mật ựộ vi khuẩn : Kiểm tra trên môi trường KingB.
Dùng que chang thuỷ tinh (ựã vô trùng), chang ựều lên mặt môi trường trong hộp peptri. Ủ ở ựiều kiện nhiệt ựộ thắch hợp là 30oC. Sau 2- 4 ngày, quan sát và ựếm số khuẩn lạc mọc trên các hộp peptri. Số lượng khuẩn lạc ựược tắnh bằng công thức:
N= dn+∑0,1CmV Trong ựó:
N: là số VSV trong một ựơn vị kiểm tra ( CFU/ ml)
∑C : là tổng số khuẩn lạc ựếm ựược trên tất cả các ựĩa peptri ựược giữ lại n: là số ựĩa ựược giữ lại ở ựộ pha loãng thứ nhất
m: là số ựĩa ựược giữ lại ở ựộ pha loãng thứ hai
d: là hệ số pha loãng tương ứng với ựộ pha loãng thứ nhất V: là thể tắch dịch cấy trên mỗi ựĩa.
2.4.2. đo pH
2.4.3. Chỉ tiêu BOD
Phương pháp nuôi cấy và pha loãng. Dụng cụ sử dụng là máy ựo YSI 5000, tủ nuôi.
2.4.4. Chỉ tiêu chất rắn lơ lửng SS
Sử dụng phương pháp khối lượng ựể xác ựịnh. Thiết bị và dụng cụ bao gồm: cân phân tắch, tủ sấy.
2.5. Mật ựộ tế bào VSV
Mật ựộ tế bào VSV ựạt cao nhất sau 2- 3 ngày tuỳ thuộc các chủng giống VSV, sau ựó mật ựộ này sẽ giảm dần. VSV sẽ ựược nuôi lắc trên môi trường dịch thể chuyên tắnh, khi ựạt mật ựộ cao nhất thì ựem ựánh giá hoạt tắnh sinh học, ựồng thời cho vào xử lý nước thải tinh bột sắn.
2.6. Phương pháp xác ựịnh hoạt tắnh sinh học
2.6.1. Xác ựịnh hoạt tắnh phân giải xenlluloza [12]
Xác ựịnh hoạt tắnh phân giải xenlluloza bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch ựĩa.
Nguyên tắc của phương pháp: enzym xenlulaza thuỷ phân CMC trong môi trường sẽ tạo vòng thuỷ ngân có màu vàng xung quanh lỗ ựục ựã ựược nhỏ dịch VSV và hiện màu bằng dung dịch lugol. Dựa vào kắch thước giữa ựường kắnh vòng thuỷ phân D và ựường kắnh lỗ ựục d, người ta xác ựịnh ựược hoạt tắnh CMC- aza của VSV.
Phương pháp ựược tiến hành cụ thể như sau:
+ Cân 1g CMC, 12g agar trong 1l nước cất và khử trùng. + đổ dịch lỏng vào hộp peptri có bề dày 1,5 cm.
+ Dùng dụng cụ ựục một lỗ tròn (d =10 mm) vào giữa hộp peptri ở trên. + Nhỏ 0,1 ml dịch enzym ựã li tâm vào lỗ ựã ựục. Sau ựó, chờ dịch khô, ựặt các hộp peptri vào tủ lạnh từ (6-8 giờ) ựể enzym khuếch tán. Chuyển vào tủ ấm ở nhiệt ựộ 370C ựể enzym tác dụng với cơ chất CMC.
ml nước cất), tráng ựều lên mặt thạch và chờ khoảng 15 phút. Sau ựó, gạt bỏ hết dịch lugol, quan sát vòng khuyếch tán.
+ Dùng thước ựo vòng CMC bị phân giải xung quanh lỗ ựục (vùng màu vàng trên nền ựen tắm).
Hoạt tắnh CMC- aza ựược hiển thị bằng hiệu số giữa ựường kắnh vòng phân giải D và ựường kắnh lỗ khoan d, ựơn vị ựo là cm.
2.6.2. Xác ựịnh hoạt tắnh phân giải tinh bột [10]
Xác ựịnh hoạt tắnh phân giải tinh bột bằng phương pháp khuếch tán trên thạch ựĩa, các bước ựược tiến hành tương tự phương pháp 2.6.1, thay CMC là tinh bột tan.
2.7. Phương pháp cấy vạch
Hình ảnh minh hoạ
Sử dụng phương pháp cấy vạch trên môi trường thạch thịt Ờ peptone ựể ựánh giá mối quan hệ của các chủng VSV ựược lựa chọn.
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Một số ựặc ựiểm về hình thái, sinh lý của các chủng vi sinh vật ựược tuyển chọn tuyển chọn
3.1.1. đặc ựiểm về hình thái
để phục vụ cho công tác nghiên cứu xử lý nước thải tinh bột sắn, ựề tài ựã tiến hành lựa chọn bộ chủng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ dựa vào hồ sơ chủng giống VSV ựược lưu giữ tại quỹ gen VSV Ờ Bộ môn Sinh học môi trường, Viện Môi trường Nông nghiệp. Trong nghiên cứu, ựề tài ựã sử dụng 3 chủng giống VSV do bộ môn Sinh học Môi trường - Viện Môi trường nông nghiệp cung cấp. 3 chủng VSV này ựã ựược ựánh giá là có mức ựộ an toàn sinh học cấp ựộ 2 (không gây bệnh hoặc có tiềm năng gây hại ở mức trung bình ựối với con người và môi trường), có thể sử dụng trong sản xuất chế phẩm VSV. 3 chủng VSV ựược tiến hành nuôi cấy trên môi trường dịch, sau 2- 4 ngày quan sát ựặc ựiểm của mỗi chủng, kết quả ựược trình bày tại bảng 3.
Bảng 3 : đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc của các chủng giống VSV sử dụng trong nghiên cứu
Kắ hiệu
chủng Mùi
đường kắnh
khuẩn lạc đặc ựiểm
B17 Không mùi 1,3 - 1,8 mm
- Sau 3 ngày nuôi cấy cho khuẩn lạc màu trắng ựục, bề mặt nhẵn, không mùi.
- Khi nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể tạo dịch trong.
YT02 Thơm dịu 1,5 - 2,0 mm
- Khuẩn lạc có màu trắng sữa, bề mặt trơn nhẵn, mùi thơm dịu. - Khi nuôi cấy lắc trong môi trường dịch thể cho dịch ựục. - Khi nuôi cấy tĩnh thì tạo váng trên bề mặt môi trường.
XKđL Hôi 1,5 - 2,3 mm
- Khuẩn lạc có màu trắng sáng, không trong suốt, bề mặt nhăn, mùi hôi.
- Khi nuôi cấy lắc trong môi trường dịch thể tạo thành các hạt nhỏ, dịch môi trường trong suốt trong thời gian nuôi cấy.
- Khi nuôi cấy tĩnh tạo váng trên bề mặt môi trường dịch thể.
Ảnh 1: Hình thái khuẩn lạc Ảnh 2: Hình thái khuẩn lạc XKđL vi khuẩn B17
3.1.2. Mật ựộ tế bào của các chủng VSV sau khi nuôi lắc
Các chủng VSV sử dụng trong nghiên cứu ựược nuôi lắc trên những môi trường dịch ựặc hiệu. Kết quả kiểm tra mật ựộ tế bào vi sinh vật tại các thời gian nuôi cấy khác nhau ựược trình bày ở bảng 4.
Bảng 4 : Mật ựộ tế bào vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu Mật ựộ tế bào (CFU/ml) Thời gian (giờ) B17 YT02 XKđL 0 2,5 x 105 0 3,5 x 105 Sau 24 1,2 x 106 4,2 x 106 3,7 x 106 Sau 48 5,3 x 107 1,5 x 107 7,3 x 106 Sau 72 7,6 x 109 8 x 109 5,2 x 108 Sau 96 8,2 x 107 2 x 107 3,4 x 106
Kết quả kiểm tra cho thấy chủng B17 khi ựược nuôi lắc trên môi trường dịch KingB sau 72h ựạt mật ựộ cao nhất là 7,6 x 109(CFU/ml), sau ựó mật ựộ VSV giảm dần ở các giờ nuôi tiếp theo.
mật ựộ cao nhất là 8 x 109 (CFU/ml)sau 72h, sau ựó mật ựộ VSV giảm dần ở các giờ nuôi tiếp theo.
Chủng xạ khuẩn XKđL khi ựược nuôi lắc trên môi trường Gause ựạt mật ựộ cao nhất là 5,2 x 108 (CFU/ml) sau 72h ), sau ựó mật ựộ VSV giảm dần ở các giờ nuôi tiếp theo.
3.2.đặc ựiểm sinh học của các chủng vi sinh vật
3.2.1.Khả năng phân giải hợp chất hữu cơ của các chủng vi sinh vật
Hoạt tắnh sinh học của các chủng vi sinh vật thể hiện khả năng phân giải, chuyển hoá các hợp chất hữu cơ của chủng vi sinh vật ựó là mạnh hay yếu.Kết quả kiểm tra hoạt tắnh sinh học của các chủng vi sinh vật thể hiện qua bảng 5.
Bảng 5 : Hoạt tắnh sinh học của các chủng vi sinh vật đường kắnh vòng phân giải (D- d) cm Ký hiệu CMC Tinh bột Protein B17 - - 2,2 YT02 + 2,7 - XKđL 3,2 2,5 - (-): không có hoạt tắnh (+): vòng phân giải nhỏ(<0,1cm)
Ảnh 3: Hoạt tắnh phân giải Ảnh 4: Hoạt tắnh phân giải tinh xenluloza của chủng XKđL bột của chủng nấm men YT02
Số liệu bảng 6 cho thấy:
+ Chủng YT02 và XKđL ựều có khả năng phân giải tinh bột, ựường kắnh vòng phân giải lần lượt là: 2,7 cm và 2,5 cm.
+ Chủng B17 có khả năng phân giải protein, ựường kắnh vòng phân giải là 2,2cm.
+ Chủng XKđL có khả năng phân giải xenluloza trên môi trường CMC, ựường kắnh vòng phân giải là 3,2 cm.
Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu khoa học trên thế giới ựã chứng minh ựược chủng nấm men YT02 có khả năng làm mất mùi và ổn ựịnh pH trong nước thải.
3.2.2.Mối quan hệ của các chủng vi sinh vật
Trên cơ sở ựánh giá mối tương tác giữa các chủng vi sinh vật ựã có,ựề tài ựã sử dụng phương pháp kiểm tra tắnh ựối kháng ựể xác ựịnh mối quan hệ giữa các chủng vi sinh vật ựược lựa chọn.
Dùng phương pháp cấy vạch sau 2 - 3 ngày, kiểm tra thấy các ựường cấy vạch không bị cụt ựầu hay ựứt quãng. Kết quả ựánh giá mối quan hệ cho thấy cácchủng vi sinh vật ựược lựa chọn không ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nhau, chúng không gây ức chế lẫn nhau. Do vậy có thể sử dụng các chủng giống vi sinh vật này trong quá trình xử lý.
3.3. Nghiên cứu sử dụng hỗn hợp vi sinh vật trong xử lý nước thải của nhà máy chế biến tinh bột sắn
Nhà máy chế biến tinh bột sắn Elmaco Ninh Bình là một trong những cơ sở chế biến tinh bột quy mô lớn ở tỉnh Ninh Bình. Với công suất 100 tấn/ngày hoạt ựộng của nhà máy ựã góp phần dịch chuyển cơ cấu kinh tế xã hội, tạo việc làm cho một bộ phận lao ựộng, góp phần phủ xanh ựất trống ựồi trọcẦ Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ắch kinh tế, xã hội do nhà máy mang lại thì hoạt ựộng sản xuất của nhà máy không tránh khỏi gây ô nhiễm môi trường. Chất thải của nhà máy bao gồm: Khắ thải, chất thải rắn và nước thải. đặc biệt là vấn ựề xử lý nước thải ựang là vấn ựề quan trọng nhất ựối với nhà máy chế biến tinh bột sắn Elmaco Ninh Bình hiện nay.
* Hiện trạng xử lý nước thải của nhà máy Elmaco Ninh Bình
Với công suất 100 tấn/ngày lượng nước thải thải ra sau sản xuất của nhà máy khoảng 1400 Ờ 1500 m3/ngày. Hiện tại nước thải của nhà máy chưa ựược phân luồng mà tất cả ựược xả chung vào hệ thống xử lý nước thải gồm các bể lắng, lọc và các hồ sinh học có diện tắch 0,5 ha, ựược xây dựng từ khi nhà máy bắt ựầu hình thành. Tuy nhiên hiện nay hiệu suất xử lý của hệ thống này rất thấp do nước thải có hàm lượng các chất ô nhiễm ựặc biệt là ô nhiễm hữu cơ quá cao trong khi quá trình làm sạch tự nhiên của các hồ không ựáp ứng ựược yêu cầu xử lý nước thải. Do ựó nước thải sau khi ra khỏi hồ vẫn rất ô nhiễm, ựiều này gây ảnh hưởng ựặc biệt nghiêm trọng tới môi trường sống của người dân và sinh vật sinh sống xung quanh nhà máy.
* Thành phần của nước thải của nhà máy Elmaco Ninh Bình
Nước thải sau sản xuất tinh bột sắn ựược thải ra từ hệ thống rửa củ và vệ sinh nhà xưởng, các công ựoạn trắch ly, tách bã, thành phần chủ yếu của nước thải này là các hợp chất hữu cơ hoà tan và một ắt tinh bột bị thất thoát. Số liệu ựược thể hiện dưới bảng 6.
Bảng 6 : Chất lượng mẫu nước thải tinh bột sắn