3. Đối tợng nghiên cứu
2.1.3.Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp giữa các phơng pháp phổ:
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR đợc đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi CDCl3.
- Phổ 13C - NMR, DEPT, đợc đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung môI CDCl3.
- Phổ HMBC, HSQC.
- Phần mềm phổ mô phỏng ACD/HNMR BD.
(Các phổ trên đều đợc đo tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Thiết bị và hoá chất 2.2.1.1. Thiết bị - Cột sắc ký thờng (chiều dài 1,4 m; đờng kính 4,5 cm). - Cột sắc ký thờng (chiều dài 0.5 m; đờng kính 2 cm). - Bộ chng cất thờng. - Các thiết bị đo phổ. - Các vật dụng cần thiết khác. 2.2.1.2. Hoá chất - Axit sunfuric. - Axeton. - Butanol. - Clorofom.
- Etylaxetat. - Metanol. - Hexan. - Nớc cất. - Iốt. - Silicagel. - Etanol 960. 2.2.2. Tách và xác định cấu trúc hợp chất 2.2.2.1. Tách các hợp chất
-Thu hái mẫu
Vỏ cây vối đợc thu hái vào tháng 02 năm 2010 ở phờng Lê Mao, thành phố Vinh, tỉnh Nghệ An, đợc mẫu tơi. Mẫu sau khi lấy về đợc rửa sạch, chặt nhỏ sau đó ngâm qua etanol 960 (nhằm tiêu diệt một số vi khuẩn và men gây mốc) rồi phơi trong bóng râm cho đến khô.
- Chiết và tách các hợp chất từ vỏ cây vối
Vỏ cây vối sau khi làm khô cân đợc 5,0 kg, sau đó mẫu đợc ngâm trong metanol trong khoảng thời gian 30 ngày rồi lọc tách và cất thu hồi dung môi thu đợc cao metanol (100g).
Cao metanol đợc hòa với nớc cất rồi chiết lần lợt với các dung môi n- hexan, etyl axetat, clorofom, butanol và cất thu hồi dung môi thu đợc các cao tơng ứng.
Cao clorofom đợc trộn đều với silicagel theo tỉ lệ 1 : 1 rồi đợc nhồi vào cột sắc ký với pha tĩnh là silicagel (Mesch) cỡ hạt 0,004 - 0,063 mm (254 - Merck). Tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải là clorofom - metanol với tỉ lệ tăng dần độ phân cực, lấy lần lợt các thể tích xác định (80 ml) chảy ra khỏi cột, cất thu hồi dung môi một phần rồi cho bay hơi tự nhiên thu đợc các phân đoạn tơng ứng ở bảng sau:
TT Hệ dung môi CHCl3/MeOH Tỉ lệ Phân đoạn 1 CHCl3 /MeOH 100 : 0 1 : 10 2 CHCl3 /MeOH 90 : 10 11 : 28 3 CHCl3 /MeOH 80 :20 29 : 60 4 CHCl3 /MeOH 75 :25 61 : 77 5 CHCl3 /MeOH 70 : 30 78 : 100 6 CHCl3 /MeOH 65 : 35 101 : 198 7 CHCl3 /MeOH 60 : 40 116 : 140 8 CHCl3 /MeOH 50 : 50 141 : 169 9 CHCl3 /MeOH 10 : 90 171 : 200
Hợp chất A: Tại phân đoạn 31 có một lợng chất màu vàng đục kết tinh.
Dùng hexan và axeton rửa nhiều lần sau đó kết tinh trong dung môi MeOH thu đợc một hợp chất màu trắng hình kim kí hiệu là chất TDV 9.
Hợp chất TDV 9 đợc kiểm tra ở SKLM với hệ dung môi rửa giải là CHCl3 /MeOH tỉ lệ 7 : 3, hiện hình bằng iot cho một vết tròn màu vàng nâu với hệ số Rf=0,6.
Hợp chất B: Tại phân đoạn 41 có một lợng chất màu vàng nhạt kết tinh.
Dùng hexan và axeton rửa nhiều lần sau đó kết tinh trong hệ dung môi MeOH : Axeton thu đợc một hợp chất màu trắng hình kim kí hiệu là chất TDV 7.
Hợp chất TDV 7 đợc kiểm tra ở SKLM với hệ dung môi rửa giải là CHCl3 /MeOH tỉ lệ 7 : 3, hiện hình bằng iot cho một vết tròn màu vàng nâu với hệ số Rf=0,65.
Ngâm trong metanol 30 ngày.
Lọc dịch chiết và cất thu hồi dung môi.
Hòa tan vào nớc.
Chiết với các dung môi và cất thu hồi dung môi.
n.hexan clorofom etylaxetat butanol
Nhồi cột.
Rửa giải bằng dung môi clorofom – metanol. Mẫu khô (30 kg) Bã mẫu Cao metanol Cao hexan CAO CLOROFOM Cao (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
etylaxetat butanolCao
Hệ dung môi 80 : 20
Hình 2.1. Sơ đồ tách các hợp chất từ vỏ cây vối. 2.2.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất
Để xác định cấu trúc các hợp chất, chúng tôi sử dụng kết hợp các phơng pháp phổ:
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR đợc đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi CDCl3.
- Phổ 13C - NMR, DEPT, đợc đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung môI CDCl3.
- Phổ HMBC. - Phổ HSQC.
(Các phổ trên đều đợc đo tại Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
Hợp chất (A) TDV 9
Hợp chất (B) TDV 7
Chơng 3
Kết quả và thảo luận
Xác định cấu tạo chất hợp từ Vỏ cây vối
3.1. Xác định cấu tạo của hợp chất A (TDV 9)
Từ các số liệu phổ 1H – NMR, 13C – NMRcủa hợp chất A, so sánh với các dữ kiện phổ của các máy đo phổ cộng hởng từ hạt nhân và theo tài liệu [37, 43] đã xác định đợc cấu tạo của hợp chất A là α - amyrin axetat.
Công thức cấu tạo:
α - amyrin axetat
Phổ 1H – NMR của hợp chất A:
Phổ 1H – NMR của hợp chất A có những tín hiệu cộng hởng đặc trng sau: Proton Vinylic H12 có độ chuyển dịch hóa học δ = 5,12 ppm (t, J = 3,5Hz).
Proton H3 có độ chuyển dịch hóa học δ = 4,5 ppm (dd, J = 8,0Hz và 6,1Hz) đặc tr- ng cho proton nhóm CH liên kết với nhóm axetat (CH3COO- ).
Ba Proton 3H của nhóm axetat (CH3COO-) có giá trị δ = 2,05 ppm. Các proton của 8 nhóm metyl (CH3) có độ chuyển dịch hóa học nh sau: 3H23 có δ = 0,99 ppm (s) ; 3H24 có δ = 0,95 ppm (s)
3H25 có δ = 0,86 ppm (s) ; 3H26 có δ = 0,99 ppm (s) 3H27 có δ = 1,00 ppm (s) ; 3H28 có δ = 0,97 ppm (s) 3H29 có δ = 0,93 ppm (s) ; 3H30 có δ = 1,07 ppm (s)
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C – NMRcủa hợp chất A: Phổ 13C – NMR của hợp chất A có các tín hiệu cộng hởng của 32 nguyên tử cacbon, trong đó có các tín hiệu cộng hởng đặc trng sau:
Nguyên tử C1’ (của nhóm este –COO-) có độ chuyển dịch hóa học δ = 171,01 ppm
Tín hiệu cộng hởng có độ chuyển dịch hóa học δ = 124,35 ppm và δ = 139,66 ppm đặc trng cho các nguyên tử cacbon của liên kết đôi C12 và C13.
Tín hiệu cộng hởng có δ = 21,31 ppm đặc trng cho nguyên tử cacbon của nhóm CH3COO- (C2’ )
Nguyên tử C3 có δ = 81,0 ppm đặc trng cho nguyên tử cacbon của nhóm CH liên kết với nguyên tử oxi của nhóm axetat.
Số liệu cộng hởng từ hạt nhân của hợp chất A (TDV 9) đợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.1-Số liệu cộng hởng từ hạt nhân của hợp chất A (TDV 9) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dung môi CDCl3. TT Nhóm 13C - NMR (ppm) 13C - NMR (ppm) Tài liệu [37, 43] 1H – NMR (ppm) HMBC 1 CH2 38,5 38,5 2 CH2 23,6 23,63 Ha: 1,87 (t; 3,5) Hb: 0,84 (d; 1,5) 3 CHO 81,0 80,98 4,50 (dd; 8,0; 6,1) 2; 4; 23; 25; 1,
4 C 37,7 37,74 5 CH 55,3 55,29 6 CH2 18,3 18,27 7 CH2 32,9 36,62 8 C 40,1 40,06 9 CH 47,7 47,68 10 C 36,8 36,83 11 CH2 23,4 23,63 1,91 (t; 3,0) 12; 13 12 CH= 124,3 124,35 5,12 (t; 3,5) 9; 11; 14; 18 13 C= 139,7 139,65 14 C 42,1 41,74 15 CH2 28,1 28,41 16 CH2 26,6 26,17 Ha: 1,84 (dd; 13,5; 5,0) Hb: 0,96 (d; 4,0) 27 13 17 C 30,1 32,51 18 CH 43,0 59,10 19 CH2 35,3 39,63 20 C 28,2 29,68 21 CH2 32,9 33,76 22 CH2 39,4 41,56 23 CH3 11,6 12,12 0,99 (s) 24 CH3 16,4 16,89 0,95 (s) 5; 4 25 CH3 18,3 15,75 0,86 (s) 9; 10 26 CH3 18,6 16,83 0,99 (s) 27 CH3 20,1 23,25 1,00 (s) 28 CH3 32,2 28,76 0,97 (s) 18; 22; 16; 17 29 CH3 35,0 34,5 0,93 (s) 20; 19; 21 30 CH3 31,8 31,0 1,17 (s) 1’ C=O 171,01 171,01 2’ CH3 21,31 21,31 2,05
Hình 3.11. Phổ HMBC của hợp chất A
3.2. Xác định cấu tạo của hợp chất B (TDV 7).
Từ các số liệu cộng hởng từ hạt nhân 1H – NMR và 13C – NMR của hợp chất B, so sánh với các dữ kiện phổ của các máy đo phổ cộng hởng từ hạt nhân và so sánh với các số liệu phổ NMR của các tài liệu [38,40], đã xác định đợc cấu tạo của hợp chất B là epifriedelanol có tác dụng chống khối u.
Công thức cấu tạo:
epifriedelanol
Phổ 1H – NMR của hợp chất B:
Phổ 1H – NMR của hợp chất B có những tín hiệu cộng hởng đặc trng sau: Tín hiệu cộng hởng δ = 3,71 ppm đặc trng cho proton H3 của nhóm CH liên kết với nhóm OH (nhóm -CHOH)
8 nhóm metyl (CH3) có tín hiệu cộng hởng Singlet, độ chuyển dịch hóa học nh sau:
3H23 có δ = 0,93 ppm ; 3H24 có δ = 0,86 ppm 3H25 có δ = 0,89 ppm ; 3H26 có δ = 0,97 ppm 3H27 có δ = 1,01 ppm ; 3H28 có δ = 1,15 ppm 3H29 có δ = 0,95 ppm ; 3H30 có δ = 1,00 ppm
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C – NMR của hợp chất B: Phổ 13C – NMR của hợp chất B có các tín hiệu cộng hởng đặc trng sau:
Các nguyên tử cacbon của 8 nhóm metyl (CH3) có độ chuyển dịch hóa học nh sau: C23 có δ = 11,6 ppm ; C24 có δ = 16,4 ppm C25 có δ = 18,3 ppm ; C26 có δ = 20,1 ppm C27 có δ = 18,6 ppm ; C28 có δ = 32,2 ppm C29 có δ = 35,0 ppm ; C30 có δ = 31,8 ppm
Các số liệu cộng hởng từ hạt nhân của hợp chất B (TDV 7) đợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.2-Số liệu cộng hởng từ hạt nhân của hợp chất B (TDV 7)
dung môi CDCl3. TT Nhóm C 13C - NMR (ppm) 13C - NMR (ppm) Tài liệu [38,40] Dung môi pyridin 1H NMR– (ppm) 1H – NMR (ppm) Tài liệu [38,40] Dung môi pyridin HMBC 1 CH2 15,9 16,6 2 CH2 36,2 35,9 1,9 (dt; 8,5; 2,5) 1; 3; 10; 4 3 CHO 72,9 71,3 3,73 (brs) 3,71 (brs) 5; 1 4 CH 53,3 49,4 5 C 38,0 37,4 6 CH2 41,9 42,3 1,74 (dt; 12,5; 3,0) 4; 10 7 CH2 17,6 18,0 8 CH 49,3 53,5 1,28 (brs) 10; 25; 26 9 C 37,2 38,5 10 CH 61,5 61,9 11 CH2 35,4 35,5 12 CH2 30,7 30,9 13 C 38,5 38,5 14 C 39,8 39,9 15 CH2 32,5 33,1
16 CH2 35,7 36,6 17 C 30,1 30,2 18 CH 43,0 43,0 19 CH2 35,5 36,3 20 C 28,2 28,3 21 CH2 32,9 32,5 22 CH2 39,4 39,4 23 CH3 11,6 12,6 0,99 (s) 0,89 (s) 24 CH3 16,4 17,0 0,95 (s) 0,94 (s) 5; 4 25 CH3 18,3 18,6 0,86 (s) 0,83 (s) 9; 10 26 CH3 18,6 18,9 0,99 (s) 0,98 (s) 27 CH3 20,1 20,3 1,00 (s) 0,96 (s) 28 CH3 32,2 32,2 0,97 (s) 0,97 (s) 18; 22; 16; 17 29 CH3 35,0 35,1 0,93 (s) 0,92 (s) 20; 19; 21 30 CH3 31,8 32,0 1,17 (s) 1,14 (s)
Kết luận
1. Bằng phơng pháp chiết với dung môi metanol, sau đó lần lợt chiết với các dung môi hexan, clorofom, etylaxetat, butanol và cất thu hồi dung môi lần lợt thu đợc các cao tơng ứng. Cao clorofom sử dụng sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel (Mesch), hệ dung môi rửa giải clorofom – metanol với tỉ lệ tăng dần độ phân cực lần lợt thu đợc các phân đoạn khác nhau. Tiến hành rửa và kết tinh nhiều lần, đã thu đợc hai hợp chất có kí hiệu là: A- TDV 9, B-TDV 7 từ vỏ cây vối
2. Sử dụng kết hợp các phơng pháp phổ cộng hởng từ hạt nhân một chiều (1H - NMR, 13C - NMR, DEPT, HMBC, HSQC), so sánh với tài liệu đã công bố, xác định đợc cấu tạo của hợp chất A là α - amyrin axetat. Hợp chất B là
Tài liệu tham khảo
1. Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam (2005), Viện Dợc liệu. 2. Nguyễn Xuân Dũng, Đào Hữu Vinh và các cộng sự (1985), các phơng
pháp sắc ký, NXB Khoa học Kỹ thuật.
3. Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu, Tạ Thị Khôi and Piet A. Leclercq (1984), "GC and GC/MS Analysis of the leaf oil of cleistocalyx operculatus (Roxb). Merr et Perry", Journal of Essential Oil Reseach, 6, 661-662.
4. Nguyễn Xuân Dũng, Trần Đình Thắng, Hoàng Văn Lựu,"Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu hoa sim ", Tạp chí dợc liệu, số 4 -, tập 4, Tr 108 - 109
5. Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu (1997), "Nghiên cứu thành phần hóa học cây vối ở Nghệ An", Tạp chí hóa hóa học, T 35, số 3, Tr 47 - 51
6. Nguyễn Văn Đậu, Nguyễn thị Thuận, Đỗ Thị Thanh, "Phân lập một số hợp chất từ lá cây vối (2007)", Tuyển tập công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, Tr 311 - 315 7. Phan Minh Giang, Trần Thị Hà, Nguyễn Hồng Anh, Phan Tống Sơn
(2007), "Nghiên cứu hóa thực vật cây sim (Rhodomyrtus tomentosa
(Ait) Hassk. Myrtaceae", Tuyển tập công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, Tr 340 - 345. 8. Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Ngô Văn Quang, Phan Văn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kiên (2007), "Axit asiatic phân lập từ cây sắn thuyền (syzygium resinosum) và có tác dụng lên vi khuẩn Streptoccus mutans", Tạp chí Dợc học số 7.
9. Văn Ngọc Hớng, Nguyễn Xuân Sinh (2003), "Isolasion and Identification of two triterpenoids from the leaves of Syzygium
resinosum Gagnep". 8th Eurasia comference on chemical science, Ha Noi, october 21 - 24, p.p.355
10. Đỗ Tất Lợi (2005), những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
11. Hoàng văn Lựu (1996), Nghiên cứu thành phần hóa học một số cây thuộc họ Sim (Myrtaceae) ở Nghệ An, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Hóa học - ĐHQGHN, Trờng ĐHSP Hà Nội.
12. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thị Anh Đào (1994), "Đặc tr- ng hóa học tinh dầu hoa vối (Cleistocalyx operculatus Roxb. Merr et Perry) của Việt Nam", Thông báo khoa học, Đại học S phạm Hà Nội I, (4), 32 - 34.
13. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Quang Tuệ (2004), "Thành phần hóa học của cây gioi", Tạp chí phân tíc hóa, lý và sinh học, Tập 9, số 1, Tr 20 - 23 14. Nguyễn Đức Minh (1975), Tính kháng khuẩn của cây thuốc Việt Nam,
NXB Y học.
15. Nguyễn Duy Nh (2008), "Trị tiêu chảy bằng ổi", Tạp chí Khoa học phổ thông, số 87, Tr 14 - 16
16. Http://wwwcây thuốc quý)
17. http://www.chemvn.net/chemvn/showthread.php? t=717) (10)
18. Slowing K, soll hunber M, carre tero E, Villar A. Flavonoids glycosides From Eugenia Jambos. Phyto chemistry,1994,37(1)pp.255-258
19. Nguyễn Thị Quỳnh Giang, Hoàng Văn Lựu (2011)
Tách và xác định cấu trúc hợp chất tritecpenoit từ rễ cây vối ở nghệ an Tạp chí khoa học Đại học vinh, tập 40, 1A, Tr 12 - 17
20. Nguyễn Văn Thanh, Hoàng Văn Lựu, Chu Đình Kính (2009). Nghiên cứu thành phần và cấu trúc hóa học một số hợp chất tách từ rễ cây vối
(Cleistocalyx operculatus Roxb Merr. et perry). Tạp chí hóa học T 47, 4A, Tr 442 – 445.
21. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Văn Thanh, Chu Đình Kính, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Cao Thị Hải Yến (2011)
Tách và xác định cấu trúc các hợp chất tritecpenoit, Flavonoit từ rễ cây vối. Tạp chí khoa học và công nghệ 49 (3A), Tr 118 – 124.
22. Kuiate JR, Mouokeu s, wabo HK, Tan P.(2007)
Antidermatophytic triterpenoids from Syzygium jambos (L.) Alston